侯玉珍，龙 艳，郭伦爱，陈俊锐，张绪富，戴迎春

轮状病毒(rotaviruses，RV)是引起婴幼儿和所有年龄人群病毒性胃肠炎的主要病原体，2016年引起全球大约13万例婴幼儿死亡和各年龄人群23万例死亡[1]。RV属于呼肠病毒科RV属，其基因组由11个双链RNA节段组成，分别编码6种结构蛋白(VP1-VP4，VP6，VP7)和6种非结构蛋白(NSP1-NSP6)。糖蛋白VP7和刺突蛋白VP4构成RV外衣壳，VP4蛋白经胰蛋白酶切割后裂解形成VP5*和VP8*两个蛋白，其中VP8*蛋白主要参与受体识别，介导病毒作用宿主细胞[2]。基于VP4序列，A组RV分为P [1]-P[40]40种基因型，基于VP8*序列，RV分为P[I]-P[V] 5个基因组[3-4]。 P[I]、P[IV]、P[V]主要感染动物，P[II]只感染人，P[III]既能感染人，也能感染动物。P[1]、 P[2]、P[3]和P[7]属于P[I]基因组，人群中广泛流行的P[4]、P[6]和P[8]属于P[II]基因组，P[9]、P[14]和P[25]属于P[III]基因组。

研究发现RV VP8*可以识别HBGA作为其感染受体或配体[2,5]。HBGA具有丰富的多态性，包括ABO、分泌型和Lewis三个基因家族，在世界人群中广泛分布[6]。不同P型的RV与HBGA的结合具有型别特异性，不同人群对各型RV易感性也存在差异[7]。因而，研究RV与HBGA的相互作用对于阐明RV的感染机制及宿主范围具有重要意义。

2009-2014年间P[9]RV在我国成都、武汉和济南等地被检出[8-10]。P[9]RV属于P[III]基因组，既能感染人也能感染犬和猫[11]，具有在人和动物中跨物种传播的潜在可能。本研究表达和纯化了P[9]RV VP8*蛋白，对其与HBGA的结合特征进行了研究，同时，检测广东汕尾地区人群P[9]RV抗体水平，分析P[9]RV抗体与HBGA的相关性，为RV感染机制的研究及疾病防控提供一定的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1样本采集 于2015年1月24-27日采集广东省汕尾市3～88岁(平均年龄51.2岁)一般人群配对的唾液和血清样本206份；266份唾液样本源于南方医院并已确定HBGA表型，为本实验室保存[12]，随机选取45份用于本研究HBGA结合试验。

1.1.2试剂 感受态细胞TOP10和BL21购于天根生化科技有限公司，质粒提取试剂盒，琼脂糖切胶回收试剂盒，T4连接酶，BamHI和SalI内切酶购自美国thermo fisher scientific公司，GST-Resin购自上海七海富泰生物科技有限公司，凝血酶购自英国GE公司，LB肉汤、LB琼脂购自北京路桥，氨苄青霉素、IPTG购自sigma， HRP-羊抗人IgG购自美国Abcam，表达载体pGEX-4T-1和兔抗VP8*血清为本实验室保存。

1.2 方法

1.2.1P[9]RV VP8*基因序列合成 P[9]RV VP8*基因序列参照GenBank公布的AB077766基因序列，序列范围位于10-702位点共693个碱基，在VP8*基因序列的上、下游分别加入BamH I和SalI酶切位点，序列由华大基因合成。

1.2.2pGEX-4T-1-VP8*重组表达载体的构建 将华大基因提供的含有质粒pUC57-VP8*的穿刺菌涂于含氨苄青霉素(100 mg/mL)的营养琼脂平板，根据thermo fisher scientific提质粒试剂盒说明书提取质粒后进行BamH I和SalI双酶切，切胶纯化VP8*基因片段与经BamHI和SalI双酶切的pGEX-4T-1表达载体连接，连接产物转化至感受态细胞TOP10，pGEX-4T-1-VP8*重组质粒经双酶切鉴定。

1.2.3重组pGEX-4T-1-VP8*蛋白的诱导表达与纯化 将鉴定正确的重组质粒转化到感受态细胞BL21，挑取单个菌落接种于4个5 mL含有氨苄青霉素(100 mg/mL)的LB液体培养基中，37 ℃，200 r/min震荡培养12～16 h，将培养物以1∶100的稀释度接种于新鲜LB液体培养基中，37 ℃震荡培养3.5 h至OD600为0.4～0.6，加入IPTG至终浓度为0.4 mmol/L。继续22 ℃ 220 r/min震荡培养12～16 h。于4 ℃，5 000 r/min离心菌液12 min，弃上清，收集菌体，用80 mL PBS充分重悬菌体，并将菌液于冰浴中对其进行超声破碎，于4 ℃，12 000 r/min离心75 min。利用GST-resin对GST融合蛋白进行纯化获得GST-VP8*，或者用凝血酶除去融合蛋白的GST标签蛋白，纯化获得VP8*进行SDS-PAGE电泳检测。

1.2.4VP8*蛋白的Western blot鉴定分析 取10 μLVP8*蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，转印至硝酸纤维素膜，依次用5% BSA封闭、兔抗VP8*血清(1∶1 000)、HRP-羊抗兔IgG(1∶3 000)孵育、PBST充分洗涤，最后HRP-DAB底物显色。

1.2.5各型唾液HBGA受体与GST-VP8*蛋白结合的梯度试验 应用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测[12]，在南方医院采集的唾液样本中随机选取各型HBGA(分泌型A、B、O和非分泌型N)各两份，将唾液用PBS缓冲液按终浓度1∶1 000稀释后每孔100 μL包被于96孔酶标板上，4 ℃过夜；0.05%PBST洗板5次，每孔加入5%脱脂奶粉-PBS 200 μL于37 ℃封闭1 h；0.05%PBST洗板5次，将P[9]RV GST-VP8*蛋白经1%脱脂奶粉-PBS3倍梯度稀释(15 μg/mL，5 μg/mL和1.7 μg/mL)后，加入到相应的孔中，37 ℃孵育1 h；0.05%PBST洗板5次，每孔加入兔抗VP8*血清(1∶3 000)100 μL，37 ℃反应1 h；0.05%PBST洗板5次，每孔加入HRP-羊抗兔IgG(1∶3 000)100 μL，37 ℃反应1 h；0.05%PBST洗板5次，使用TMB避光显色10 min后每孔加入100 μL 2 mol/L磷酸终止反应，测定波长为450 nm的吸光值，阳性信号的截断值为背景/空白孔的平均值加三倍标准差约为OD450=0.2。

1.2.6唾液样本与P[9]RV结合试验 将45份在南方医院采集的唾液样本(HBGA分型A型21份，B型8份，O型8份，N型8份)用PBS缓冲液按终浓度1∶1 000稀释后每孔100 μL包被于96孔酶标板，4 ℃过夜；0.05%PBST洗板1次，每孔加入5%脱脂奶粉-PBS 200 μL于37 ℃封闭1 h；0.05%PBST洗板1次，每孔加入1%脱脂奶粉-PBS稀释的GST-VP8*蛋白(10 μg/mL)100 μL，37 ℃孵育1 h；0.05% PBST洗板5次，每孔加入兔抗VP8*血清(1∶3 000)100 μL，37 ℃反应1 h；0.05%PBST洗板5次，每孔加入HRP-羊抗兔IgG(1∶3 000)100 μL，37 ℃反应1 h；0.05%PBST洗板5次，使用TMB避光显色10 min后每孔加入100 μL 2 mol/L磷酸终止反应，测定波长为450 nm的吸光值。

1.2.7血清中P[9]RV特异性IgG的检测 206份血清样本取自广东省汕尾市的一般人群。利用P[9]RV VP8*蛋白作为捕获抗原，采用ELISA检测血清样本中P[9]RV特异性IgG抗体。用PBS缓冲液稀释VP8*蛋白至0.5 μg/mL每孔100 μL包被于96孔酶标板上，4 ℃过夜；0.05%PBST洗板1次，每孔加入5%脱脂奶粉-PBS 200 μL于37℃封闭1 h；0.05%PBST洗板1次，每孔加入1%脱脂奶粉-PBS两倍梯度稀释的血清样本，37 ℃孵育1 h；0.05%PBST洗板1次，每孔加入用1%脱脂奶粉-PBS稀释的HRP-羊抗人IgG(1∶3 000)，37 ℃反应1 h；0.05%PBST洗板5次，使用TMB避光显色10 min后每孔加入100 μL 2 mol/L磷酸终止反应，测定波长为450 nm的吸光值。

1.2.8唾液HBGA表型鉴定 206份唾液样本取自广东省汕尾市的一般人群。唾液HBGA表型检测包括ABO、Lewis以及分泌型，采用ELISA方法检测。将煮沸的唾液用PBS缓冲液1∶1 000稀释后每孔100 μL包被于96孔酶标板上4 ℃过夜；0.05%PBST洗板1次，每孔加入5%脱脂奶-PBS 200 μL于37 ℃封闭1 h；0.05%PBST洗板1次，将单克隆抗体包括A、B、H、Lewis b、Lewis x和Lewis y经1%脱脂奶粉-PBS 1∶300稀释后，加入到相应的孔中，37 ℃孵育1 h；Lewis a 4 ℃过夜；0.05%PBST洗板5次；其中Lewis a相对应的二抗为HRP-羊抗鼠IgG(1∶300)；余为HRP-羊抗鼠IgM(1∶300)，37 ℃，反应1 h；0.05%PBST洗板5次，使用TMB显色10 min后每孔加入100 μL 2 mol/L磷酸终止反应，测定波长为450 nm的吸光值。

1.2.9统计分析 采用SPSS 23.0统计软件进行统计分析。抗体阳性和阴性两组HBGA表型比较采用χ2检验，不满足χ2检验条件时，采用Fisher确切概率法检验，检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1pGEX-4T-1-VP8*表达载体的构建 pGEX-4T-1-VP8*重组质粒经BamH I与SalI双酶切鉴定，获得大小约5 kb的pGEX-4T-1载体和700 bp的VP8*片段(图1)，表明成功构建pGEX-4T-1-VP8*表达质粒。

M：DNA分子量标准；1：pGEX-4T-1-VP8*双酶切产物图1 pGEX-4T-1-VP8*重组质粒BamHI与Sal I双酶切鉴定Fig.1 Production of pGEX-4T-1-VP8* plasmid digested by BamH I and Sal I

2.2P[9]RVVP8*蛋白的表达与纯化 通过原核表达系统，得到可溶形式的P[9]RV VP8*蛋白，SDS-PAGE电泳结果显示：融合蛋白大小约为52 kD条带，经凝血酶去除GST标签蛋白后获得约为28 kD 的目的蛋白，与预期VP8*蛋白大小一致(图2)。为了进一步验证原核表达系统表达VP8*蛋白的特异性，将SDS-PAGE凝胶分离的目的蛋白转印到PVDF膜上，经特异性抗体进行Western blot分析，在大小为52 kD和28 kD位置显示条带，证明了研究所用的原核表达系统BL21(DE3)表达的VP8*蛋白具有特异性(图3)。

M：蛋白质分子量标准；1：纯化的GST-VP8*蛋白；2：凝血酶切后VP8*蛋白图2 纯化GST-VP8*蛋白的SDS-PAGE检测Fig.2 Production of the GST-VP8* fusion protein

M：蛋白质分子量标准；1：纯化的GST-VP8*蛋白；2：凝血酶切后VP8*蛋白图3 纯化P[9]VP8*蛋白Western blot印迹分析Fig.3 Western blot analysis of the P[9]VP8* protein

2.3P[9]RV GST-VP8*蛋白与唾液HBGA受体 结合P[9]RVGST-VP8*蛋白与唾液HBGA受体的结合情况如图4所示。GST-VP8*蛋白与A型分泌型HBGA受体结合，且呈梯度反应关系，与B、O型和非分泌型不结合。进一步以中国人群唾液样本验证P[9]RV与HBGA受体结合特征，随机抽取45份唾液样本用于本研究验证，根据梯度实验结果，为保证OD值的有效性及背景值的可参考性，我们把后续实验中GST-VP8*蛋白与唾液HBGA受体结合实验的浓度定为10 μg/mL。结果如图5所示：GST-VP8*蛋白与A型分泌型HBGA受体结合，与B、O型和非分泌型不结合。各型OD均值分别为A=0.751，B=0.135，O=0.130，N=0.160。

注：1×，3×，9×表示三倍梯度稀释的GST-VP8*蛋白浓度分别为15 μg/mL，5 μg /mL和1.7 μg/mL图4 P[9]RV与唾液HBGA受体结合梯度图Fig.4 Binding activity of P[9]RV to HBGA receptor

图5 P[9]RV与唾液样本结合方式Fig.5 Binding activity of P[9]RV to saliva sample

2.4血清P[9]RV IgG抗体与唾液HBGA表型的关系 采集广东省汕尾市206名一般人群配对的血清和唾液样本，检测血清P[9]RV特异性IgG抗体滴度和唾液HBGA表型。206份血清样本中P[9]RV特异性IgG检出率为13.6%(28/206)。血清P[9]RV特异性IgG与HBGA表型有关。与P[9]RV特异性IgG阴性的个体相比，A型HBGA受体在P[9]RV特异性IgG阳性的个体中所占的比例明显较高(P=0.001)，分泌型受体在P[9]RV特异性IgG阳性的个体中所占的比例明显较高(P=0.017)；相反，Lea+/Lex+在P[9]RV特异性IgG阳性的个体中所占的比例明显较低(P=0.014)。

表1 P[9]RV IgG抗体与唾液HBGA表型的关系
Tab.1 Association between P[9]RV IgG and the phenotypes of HBGA

分型P[9]RV抗体阳性 (%)P[9]RV抗体阴性(%)P血型28178A15(53.6)32(18.0)B6(21.4)37(20.8)0.001O6(21.4)104(58.4)AB1(3.6)5(2.8)Lewis分型28178Leb+/Ley+27(96.4)129(72.5)Lea+/Lex+0(0)28(15.7)0.014Lea+b+/Lex+y+1(3.6)21(11.8)分泌状态28178分泌型28(100)150(84.3)0.017非分泌性0(0)28(15.7)

注：Leb+/Ley+和Lea+b+/Lex+y+属于分泌型，Lea+/Lex+属于非分泌型。

3 讨 论

VP8*是RV表面刺突蛋白VP4的远端，主要参与受体识别，介导病毒识别宿主细胞，研究表明，重组VP8*蛋白可以识别HBGA受体，提示VP8*蛋白可成为研究RV-HBGA相互作用的理想模型[13]。本研究以P[9]RV为对象，表达纯化了VP8*蛋白，通过唾液HBGA结合鉴定，发现P[9]RV特异性地与A型HBGA结合。国外有研究使用当地RV融合VP8*蛋白，采用血凝结合试验得出P[III]RV与A型分泌型HBGA受体结合的模式[13]。本研究利用中国人群唾液样本，证实了P[9]RV VP8*与A型分泌型HBGA受体结合，而不与B、O型分泌型HBGA受体及非分泌型HBGA受体结合。

我们还研究了一般人群血清样本中P[9]RV特异性IgG阳性率和HBGA表型之间关系。发现A型分泌型HBGA个体配对的血清中P[9]RV特异性IgG阳性率明显较高，A型分泌型存在于Leb+/Ley+和分泌型HBGA个体中，不存在于Lea+/Lex+和非分泌型HBGA个体中，因此，Leb+/Ley+和分泌型HBGA个体配对的血清中P[9]RV特异性IgG阳性率明显较高，而Lea+/Lex+和非分泌型HBGA个体配对的血清中不存在P[9]RV特异性抗体。表明A型分泌型HBGA受体可能是P[9]RV重要的宿主易感因素。

我国1980-2011年间P型RV中P[8]和P[4]为主要流行株，检出率分别为50.2%和18.2%，P[9]的检出率较低为0.9%[14]。研究RV与HBGA受体的关系有助于理解RV的流行病学。我们课题组对P[8]和P[4]RV与HBGA结合方式开展了研究[12]，发现P[8]和P[4]RV能识别具有A、B和O分泌者的HBGA受体，且分泌型人群占我国总人群的80%～90%人[15]，表明P[8]和P[4]RV具有广谱易感人群，一定程度上解释了P[8]和P[4]RV为主要流行株的原因。本研究发现P[9]RV VP8*与分泌型A型HBGA受体结合，而不与分泌型B、O型HBGA受体及非分泌型HBGA受体结合，P[9]RV易感人群范围较窄，解释了我国P[9]RV检出率低于P[8]RV检出率这一现象。

Wang等[16]发现我国两株罕见的人P[9]型RV可能来源于犬和猫。P[9]RV能够跨物种传播可能是因为这些物种具有某种相同的物质，本研究发现，P[9]RV VP8*与分泌型A型HBGA受体结合，在很多动物物种中也表达A型HBGA受体[17]，动物和人类中都具有A型HBGA抗原可能是P[9]RV跨物种传播的原因。

利益冲突：无