贾 鹏， 王凯悦， 亐开兴， 张继才， 黄必志， 苏相生， 陈 宏， 雷初朝*

(1.西北农林科技大学动物科技学院，陕西 杨凌 712100;2.云南省草地动物科学研究院，昆明 650212；3.云南省双柏县动物疫病预防控制中心，云南 双柏 675100)

滇中牛(曾名楚雄牛)属于役肉兼用型品种，其中心产区在云南省楚雄、曲靖、大理、滇中、思茅和临沧等地区。滇中牛遗传性能稳定，具有体质结实、发育匀称、体小力大、耐劳、性情温顺、行动敏捷、善于爬坡等特点，是我国优良的地方黄牛品种之一[1]。

Y染色体遗传信息是对常染色体、X染色体及线粒体DNA的重要补充，因其遵循严格的父系遗传、单倍型完整等特点，是研究动物父系遗传多样性、起源和驯化历史等问题的理想工具。近年来，基于Y染色体单核苷酸多态性(Y-SNPs)和微卫星(Y-STRs)分子标记，国内外学者对家牛(普通牛和瘤牛)进行了较为系统的父系遗传研究，结果一致表明家牛包含3个Y染色体单倍型组(即普通牛Y1和Y2以及瘤牛Y3单倍型组)[2-3]和1个新的Y1.2单倍型组[4]，Y-SNPs标记可以区分这3种Y染色体单倍型组，而Y-STRs可精细区分各单倍型组内丰富的单倍型，两种分子标记的结合使用能够更准确地反映家牛Y染色体的遗传多样性与起源历史[5]。

然而，迄今关于滇中牛品种的遗传多样性、起源和群体遗传结构的相关研究报道较少。Li等[6]分析了53头滇中牛线粒体DNA D-loop区910 bp序列的多态性，结果表明滇中牛具有普通牛和瘤牛2个母系起源，以瘤牛血统为主。此外，Xia等[7]研究了滇中牛的线粒体DNA D-loop区序列，结果同样支持滇中牛有普通牛和瘤牛2种母系起源。关于滇中牛Y染色体遗传多样性及父系起源的研究尚未见报道，因此，本研究对滇中牛2个Y-SNPs(UTY19和ZFY10)和Y-STRs(INRA189和BM861)进行测序和综合分析，以期从分子水平分析滇中牛父系遗传多样性、起源和群体遗传结构，为今后开展该品种的保种、选育策略制定和分子育种提供基础材料。

1 材料与方法

1.1 样本采集与基因组DNA提取

在云南省楚雄市双柏县采集27头滇中公牛的耳组织样带回实验室，采用苯酚—氯仿方法提取全基因组DNA，提取的基因组DNA稀释成10 ng/μL放在-20 ℃保存备用。用实验室保存的5头荷斯坦牛公牛(属于典型的Y1单倍型组)DNA做对照。

1.2 引物合成与PCR扩增

参照Ginja[2]等和Götherström[3]等报道的2个家牛Y-SNP标记(UTY19和ZFY10)引物序列信息合成引物，参照Edwards等[8]发表的2对Y-STR标记(INRA189和BM861)引物序列信息合成引物。PCR反应体系为12.5 μL：ddH2O 5.00 μL，2×Taq MasterMix 6.00 μL，上下游引物各0.25 μL(10 pmol/μL)，模板DNA 1.00 μL。扩增条件为：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，53～56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，36个循环，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。用2%的琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行电泳检测，将检测合格的PCR扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序与荧光分型。

1.3 数据统计分析

结合已经发表的家牛序列(GenBank登录号分别为AY936543和AF928827)，将UTY19和ZFY10的测序结果用SeqMan v7.1软件进行比对分析，找出相应的SNP位点。用GeneMarker V1.91软件对荧光微卫星标记INRA189和INRA189的等位基因大小进行统计。由于不同酶对微卫星结果会产生1～2 bp的影响，所以本研究同时使用荷斯坦牛微卫星数据做矫正，以保证结果的准确性。每个个体的单倍型都是利用Y-SNPs先确定家牛的单倍型组，继而结合Y-STRs的分型结果，二者共同确定出每头牛的Y染色体单倍型(Y-SNP-INRA189-BM861)。 用ARLEQUIN V3.0软件计算单倍型频率和单倍型多样度(H±SD)。

2 结果与分析

2.1 Y-SNPs多态性

利用2个Y-SNPs标记(UTY19和ZFY10)对27头滇中牛的PCR扩增产物进行测序，并将测序结果与Ginja等[2]和Götherström等[3]报道的家牛序列(GenBank登录号：AY936543和AF928827)进行比对分析，结果表明：UTY19标记在27头滇中牛全部为A碱基，ZFY10标记在27头滇中牛存在C和T两种碱基(表1)。参考Ginja等[2]和Götherström等[3]对家牛Y染色体单倍型组的判定标准，依据2个标记的核苷酸变异确定单倍型组，结果显示，27头滇中牛存在Y2(22.22%)和Y3(77.78%)2种Y染色体单倍型组，没有Y1单倍型组。

2.2 Y-STRs多态性

利用2个Y-STRs标记(INRA189和BM861)对27头滇中牛进行Y染色体微卫星多态性检测，在INRA189座位中共检测到88 bp和90 bp共2种等位基因，88 bp对应瘤牛Y3单倍型组，90 bp在普通牛和瘤牛2种单倍型组中均存在，在这27头滇中牛中仅有3头滇中牛检测到88 bp的等位基因，其余24头滇中牛均检测到90 bp的等位基因；在BM861座位中检测到2种等位基因(156 bp和158 bp)，156 bp和158 bp分别对应瘤牛Y3和普通牛Y2单倍型组。在BM861座位中，滇中牛有6头属于普通牛Y2单倍型组的158 bp等位基因，有21头属于瘤牛Y3单倍型组的156 bp等位基因(表1)。对照组荷斯坦牛在INRA189座位中均为98 bp等位基因，在BM861座位中仅检测到属于普通牛Y1单倍型组的等位基因158 bp。

表1 滇中牛Y染色体单倍型与单倍型频率

2.3 单倍型频率和单倍型多样度

参照Edwards等[5]报道的Y-SNPs和Y-STRs标记结合的单倍型分型方法，对27头滇中牛的单倍型进行分析(Y-SNP-INRA189-BM861)。27头滇中牛存在普通牛Y2(Y2-90-158)和瘤牛Y3(Y3-88-156和Y3-90-156) 2种单倍型组，其中Y2-90-158、Y3-88-156和Y3-90-156的单倍型频率分别为0.222 2，0.111 1和0.666 7，滇中牛的Y染色体单倍型多样度为0.5128±0.0904。所有荷斯坦公牛都是Y1-98-158单倍型。

3 讨 论

云南地处中国与南亚、东南亚接壤的边境地带，云南地方黄牛存在普通牛和瘤牛2种血统来源。因此，云南一些地方黄牛品种是普通牛和瘤牛的杂交后代[6]。据推测，印度瘤牛可能经过云南进入中国，云南滇中牛即是由中国瘤牛和印度瘤牛杂交而成[9]，是云南省滇中地区群众在长期的生产、生活中通过自然与人工选择而成的优良地方黄牛遗传资源。然而，迄今为止，尚未见分子水平上对滇中牛品种的父系遗传多样性、起源和群体遗传结构的相关研究报道。因此，本研究对27头滇中牛的Y-SNPs(UTY19和ZFY10)和Y-STRs(INRA189和BM861)遗传多样性进行研究。

家牛Y-SNPs和Y-STRs标记当前已被广泛用于世界牛品种/群体的遗传多样性、群体遗传结构、起源和迁徙路线等研究。在对国外家牛品种/群体的研究中，Ginga等[2]对多个欧洲家牛品种的分析表明，欧洲牛为普通牛起源，Y1单倍型组主要分布在北欧牛品种中，Y2单倍型组主要分布在南欧牛品种中。随后，Pérez-Pardal等[10]在45个欧洲和非洲牛群体中检测到Y1和Y2两种单倍型组，细分为38种单倍型。Edwards等[5]通过分析138个欧洲和亚洲牛品种也表明欧洲牛只拥有普通牛Y染色体单倍型组，其中Y1主要出现在北欧和西北欧，但在多个伊利比亚牛品种和西南亚牛品种中也有零星分布。

而在国内黄牛品种的父系遗传分析中，常振华等[11-12]等先后对中国16个地方黄牛品种进行了父系遗传多样性、群体遗传结构及起源分析，结果一致表明北方黄牛以Y2单倍型组为主，南方黄牛以Y3单倍型组为主，中原黄牛含普通牛Y2和瘤牛Y3单倍型组。为了准确判断每一个品种的单倍型多样性及其父系起源，Xia等[7]分析了34个中国黄牛品种/群体的Y-SNPs和Y-STRs多态性，研究结果表明，中国黄牛保持着高度的父系起源多样性，并且可能拥有许多起源于近东驯化中心的原牛血统。

在本研究中，笔者对滇中牛2个Y-SNPs(UTY19和ZFY10)和Y-STRs(INRA189和BM861)进行父系遗传分析。研究表明滇中牛由普通牛Y2和瘤牛Y3单倍型组组成，以Y3单倍型组为主。这与侯佳雯[13-15]等对安徽皖南牛、大别山牛、广西涠洲牛等部分南方黄牛的研究结果基本一致，说明滇中牛具有与中国南方黄牛品种相似的父系遗传组成，即以瘤牛Y3单倍型组为主。此外，也与Li[6-7]等基于线粒体DNA D-loop区对滇中牛母系起源的研究结果相吻合。

单倍型多样度是衡量一个群体变异程度的重要指标，单倍型多样度高的群体说明其遗传多样性高，遗传资源丰富。在本研究中，27头滇中牛的Y染色体单倍型多样度为0.5128±0.0904，可以看出该值低于Xia等[7]报道的34个中国黄牛品种的整体Y染色体单倍型多样度的平均值(0.607±0.016)，但高于国外牛品种的Y染色体单倍型多样度平均值(0.422±0.3)[5]，表明滇中牛的Y染色体单倍型多样度和分子遗传多样度相对较高。本研究对滇中牛遗传资源的保护和利用提供了科学依据。