饶宝蓉

(福建省南平市农业科学研究所 福建建阳354200)

杉木［Cunninghamia lanceolata（Lamb.）Hook.］又名沙木、沙树等，属松柏目杉科乔木，高30 m，胸径可达2.5～3 m，是我国特有的常绿针叶树种之一。杉木栽培历史悠久，地域分布十分广阔，是我国南方山区重要的造林树种之一［1］。杉木纹理顺直、耐腐防虫，广泛用于建筑、桥梁、电线杆、造船、家具和工艺制品等方面。据统计，我国建材约有1/4是杉木。杉树生长快，一般只要10 a就可成材，是我国南方最重要的特产用材树种之一。

杉木种子育苗子代存在长势参差不齐，出现变异株等不良性状，而组织培养技术繁殖苗木的主要优点是能够在短期内大量繁殖遗传基因型比较一致的优良材料，充分利用繁殖材料的遗传潜能，发挥最佳的效益［2-3］。从20世纪80年代就对杉木苗开展了无性系选育、扦插试验，探索了杉木扦插生根的遗传变异规律［4-6］。阙国宁［7-8］于1980年开始进行杉木组培技术试验研究，探索了不同年龄母本上外植体的嫩梢增殖规律和成年母本外植体的组培复壮技术。但是，在杉木苗外植体选取，如何处理，以期更好地建立无菌体系研究方面较少。目前，木本科植物如红豆杉、梧桐、红枫等的组培快繁仍存在组培材料消毒困难、易褐化、增殖率低及生根困难等问题。无菌体系的建立是植物组培成功的关键。其中，外植体种类、取材部位和消毒方法是影响无菌体系建立的重要因素。自然条件下，植物外植体带有较多的细菌和真菌，进行组培时需对其进行消毒灭菌，但要求不损伤其组织材料，保持生活力，使其在良好的培养条件下很快恢复生机，正常生长和繁殖［9-10］。较适的消毒方式能够杀灭细菌，降低外植体的伤害，有助于其快速适应生长环境。通过调整消毒时间或消毒剂种类［11-13］，以及消毒后去除外层老化组织［14］等方法均能达到提高无菌率的效果。杉木苗与其他作物相比生长缓慢，新发嫩枝多发于春秋两季、针叶多，茎表皮不光滑，感染率高且消毒后易褐化死亡，对其组培影响较大。为此，笔者于2015年以20 a苗龄杉木及种苗圃内1 a苗龄杉木的茎尖、茎段为外植体试材，对灭菌时间、外植体类型和取材时间等进行研究，以期筛选出杉木苗培养适宜的外植体类型，取材时间及其消毒方法，为杉木苗的无性繁殖提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

以福建省建阳区国有林场杉木试验林中选出20 a苗龄，树干笔直，生长快、生物总量高、优质、耐瘠薄等优质的杉木的春秋新稍，和种苗圃内同棵数剪下枝条扦插成活的1 a苗龄的新稍作为组培试验材料。

1.2 方法

1.2.1 外植体的预处理与接种后培养

将采回的外植体修剪成5 cm左右，剪去过长的针叶，除去表皮上的灰尘和杂物等，用洗洁精清洗并浸泡15 min，再用流水冲洗30 min，后用蒸馏水冲洗2次，转入超净工作台，备用。处理好的外植体均接到MS+6-BA 0.8 mg/L+KT 0.5 mg/L的MS诱导培养基上培养。每瓶接一个外植体，外植体大小1 cm左右，转接好后放入温度（25±2）℃，光照强度1 500～2 000 lx，光照时间12 h/d条件下培养。

1.2.2 不同消毒时间对外植体消毒效果的影响

将外植体按1.2.1方法预处理后，先用75%酒精浸泡15～30 s，后将外植体用0.1%升汞消毒，分为4个处理，4处理的消毒时间分别为6、8、10和12 min，每处理均加入1～2滴吐温80，振荡后再用无菌水冲洗4～6次，每个处理接种90个，3次重复。20 d后观察，统计。

1.2.3 不同外植体消毒效果比较

在春季将取回来的外植体按1.2.1方法进行预处理，后用1.2.2筛选出的方法进行消毒，将外植体分为3种类型，茎尖，茎段，去针叶茎段。每个处理接种90个，3次重复。20 d后观察，统计。

1.2.4 不同取材时间对外植体消毒的影响

在春季4月和秋季9月连续取材，分别取苗龄1 a和20 a的植株嫩茎段。其中，外植体均去除茎尖后紧接的一段，接种时去除针叶。进行取材季节对外植体萌芽率的影响的比较。每个处理接种30个外植体，3次重复。

1.2.5 数据统计分析

各处理培养30 d后分别统计萌芽率、感染率、死亡率，采用Microsoft Excel整理数据，并采用JMP10.0软件进行方差分析和多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同消毒时间对茎段消毒效果的影响

茎段消毒后用无菌纸吸干水分，斜插于培养基上，暗培养2 d后进行光照，以减少其褐化。培养到第5天时，茎段开始出现感染，且感染主要发生在消毒时间为6、8 min的处理。在培养1～18 d时出现较多感染，18 d后感染减少；在培养第25天时没有感染再发生，其中感染主要表现为霉菌感染。从表1可见，不同的升汞消毒时间，茎段的感染率、死亡率和萌芽率也随之发生相应变化。消毒6～12 min，随着消毒时间的延长，其感染率逐渐下降，死亡率则呈上升的趋势。其中，消毒6 min茎段感染率最高，达83.33%，显著高于8、10、12 min的，而萌芽率最低，只有6.66%；消毒10、12 min时的萌芽率分别为51.11%、43.33%，二者未达到显著差异。综合感染率、死亡率和萌芽率3个指标可见，茎段的最佳消毒时间为升汞消毒10 min。

表1 消毒剂处理时间的不同对茎段消毒效果的影响

2.2 不同外植体的消毒效果

表2可知：（1）从萌芽率上看，去针叶茎段的萌芽率最高，为40.00%，其次是茎段，萌芽率为28.33%，茎尖的萌芽率最低，为8.33%；去针叶茎段与茎段的萌芽率差异不显著，但是两者与茎尖的差异达显著。（2）从感染率上发现茎尖的感染率最高，为80.83%。茎段感染率为50.00%，去针叶茎段感染率最低，仅为37.50%；茎尖的感染率显著高于茎段和去针叶茎段，后二者差异未达到显著。（3）死亡率方面，茎尖、茎段、去针叶茎段三者的死亡率分别为10.33%、21.66%、22.50%，三者均未达显著差异。综合3个指标可见，茎尖消毒困难，杉木的外植体以去针叶茎段为好。

表2 杉木不同类型外植体的消毒效果 单位：%

表3 不同取材时间杉木外植体的消毒效果 单位：%

2.3 不同采集时间对外植体消毒效果的影响

从表3可知，由于外植体采集时间，以及外植体的苗龄的不同，其体内贮藏的营养物质及其木质化程度也有差别，致使外植体的消毒难易程度不同。其中，苗龄小（1 a）的木质化程度比较低，春季、秋季采集萌芽率分别为73.33%、51.11%，均显著高于苗龄大的（20 a），萌芽率为45.56%、12.78%。因此，相同季节采集的外植体，苗龄小的萌芽率优于苗龄大的。苗龄小的感染率显著低于苗龄大的。这与苗龄小枝条木质化程度低，带菌量少，较易消毒有关；同时，由于苗龄小处于生长期，其体内的酚类物质含量相对较高，使得外植体消毒后易出现褐化死亡，又因其较为幼嫩，消毒剂对其组织伤害也较大。因此，苗龄低感染率较低，但是褐化死亡率较高，分别为12.22%和14.44%。从表3还可以看出，在同苗龄的前提下，春季采集的茎段，其消毒效果优于秋季，如20 a苗龄的苗木，春季采集萌芽率45.56%，而秋季只有12.78%，达到显著性差异。苗龄1 a的苗木，春季采集萌芽率为73.33%，与秋季的萌芽率53.11%达显著性差异。综合以上因素，在春季取材，选择1 a苗龄的杉木有利于无菌体系建立。

3 讨论与结论

研究结果表明，杉木的外植体选择以茎段为好，且以消毒后去针叶的茎段进行组培效果最好，启动率高，芽长势好（图1）；春稍比秋稍更有利于无菌体系建立，因此采集时间上比较，春季优于秋季。年限上，苗龄小比苗龄大的更有利于无菌系建立。苗龄小木质化低，更有利于细胞的增殖与分化，这与黄发新等［15］对不同生理老化程度的杉木组培效果中总结出杉木成年树上部枝条组培时其芽分化数、嫩梢数和长度、生根率均极显著地低于树干根颈萌条，在机理上有一定的相似性。此外，杉木苗外植体在消毒过程中，消毒时间适当延长可以降低感染，但是会伤害到组织导致外植体死亡率升高，萌芽率下降。消毒时间与外植体木质化程度、暴露于空气中的时间、杂菌等附作物有关，因此，外植体消毒时，要掌握好各个指标的平衡关系，尽量减少因消毒产生的对外植体的伤害，以免使外植体消毒后在培养过程中启动慢，或者不启动［16］。杉木苗组培过程中出现的褐化问题与唐军荣等［17］在红花山玉兰组织培养外植体的选择及其消毒方法一文中对红花山玉兰的研究有相似之处，都存在外植体极易产生褐化，在其切口处会分泌较多的酚类物质逐渐渗入到培养基，导致外植体死亡。该试验通过添加活性炭和抗坏血酸及结合缩短转接时间对降低外植体的褐化率起到了一定的效果。

图1 杉木茎段外植体组培效果