郭海州 安生花 林明哲 李进章 周毛 祁艳娟

(青海大学附属医院 1宁养院，青海 西宁 810001；2肿瘤内科；3肿瘤放疗科)

肝细胞癌起源于肝细胞，发生于硬化性的肝组织内。肝炎病毒、酒精、代谢性疾病、药物等是肿瘤发生的重要危险因素〔1〕。病变发生时可以观察到相关基因和蛋白的表达失调〔2〕。Aurora激酶(Aurora)-A、Aurora-B是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，能对细胞的有丝分裂和增殖起重要作用，近年认为二者的作用可能更多，如对转移的促进作用等〔3,4〕。组织蛋白酶(Cath)-D是机体中的水解酶，可以对细胞外基质成分进行降解，对细胞的迁移提供支持作用〔5〕。本研究应用免疫组化和荧光PCR技术检测肝细胞癌中Aurora-A、Aurora-B和Cath-D表达特征，并进行对照观察，关注蛋白之间的相关性及对判断预后的价值。

1 资料和方法

1.1临床资料 选择2015年2月至2017年10月青海大学附属医院收治的肝细胞癌患者共65例作为观察组1，纳入标准：①均行手术治疗，且经术后病理确诊；②符合世界卫生组织(WHO)中肝细胞癌的诊断标准及分型。排除标准：①合并其他器官恶性肿瘤；②具有先天发育异常；③有消化系统手术史；④混合性癌。其中男35例，女30例，年龄46～89〔平均(60.9±9.2)〕岁。其中高-中分化42例，低分化23例。患者或家属签署知情同意书。选择25例肝细胞腺瘤术后组织作为对照组1，男13例，女12例，年龄44～80〔平均(57.7±8.9)〕岁。选择观察组中距肿物边缘大于3 cm的非肿瘤性的肝组织(正常肝组织)25例作为正常对照组1，男14例，女11例，年龄47～85〔平均(59.8±7.1)〕岁。选择观察组1中的新鲜肿瘤组织15例作为观察组2，其中男8例，女7例，年龄44～79〔平均(61.2±7.8)〕岁。选择对照组1中的新鲜肝细胞腺瘤组织15例作为对照组2，其中男8例，女7例，年龄47～78〔平均(59.8±7.5)〕岁。选择正常对照组1中的新鲜正常肝组织15例作为对照组3，其中男8例，女7例，年龄48～75〔平均(58.8±6.9)〕岁。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2免疫组化方法检测蛋白的表达 观察组1、对照组1、正常对照组1术后均常规切取1.5×1.0 cm、厚2.0 mm的组织，应用中性甲醛进行固定12 h以上，脱水后并石蜡包埋，切4 μm的切片置于胶片上。Aurora-A、Aurora-B和Cath-D均购自苏州睿赢生物公司。Aurora-A、Aurora-B和Cath-D的试剂均为浓缩液，先进行预实验，并选择Aurora-A为1∶300、Aurora-B为1∶250，Cath-D为1∶100显色最理想的浓度用于正式实验。三种蛋白的检测均基于石蜡切片，正式实验应用免疫组化SP法，二氨基联苯胺(DAB)显色，均严格按照操作说明进行，均由同一名实验师进行全程操作，做好质控工作(设阳性对照)。

1.3荧光PCR检测mRNA的表达 应用荧光PCR技术检测观察组2、对照组2和正常对照组2中Aurora-A、Aurora-B和Cath-D的mRNA表达水平。GAPDH上游引物：5′-CTTTAGTATCTTGGAAGGACTC-3′,下游引物：5′-GTAGAGGCAGGGATGAGTCCT-3′，扩增长度149 bp；Aurora-A上游引物:5′-TGGAATATGCACCACTTGGA-3′，下游引物：5′-ACTGACCACCCAAAATCTGC-3′，扩增长度208 bp；Aurora-B上游引物：5′-GATGGTCCCTGTCATTCAC-TCGGGTGCGTGTGTTTGTATG-3′,下游引物：5′-TCTGTGTATGTATAGGG-3′，扩增长度105 bp；Cath-D上游引物：5′-TGGAACAGAAGACCACTCTCATCGAT-3′，下游引物：5′-GCAACGATCTTCGTCAAACATCGTA-3′，扩增长度76 bp。操作严格按实验步骤完成，均由同一实验师完成，并设阳性对照和阴性对照，做好质控工作。扩增程序：95℃ 10 min(1个循环)，95℃ 25 s(10个循环)，67℃ 20 s(10个循环)，95℃ 20 s(35个循环)。

1.4结果判定 免疫组化结果的判定：Aurora-A、Aurora-B和Cath-D的显色部位均是细胞质，以染成棕黄色颗粒为阳性细胞。在显微镜下寻找染色明显的上皮细胞分布区(热点区)，共选择5个视野(400倍)进行计数，以<10%为阴性，以≥10%为阳性。计算阳性率。

荧光PCR结果的判定：判定羟基荧光素(FAM)、甲基荧光素(VIC)、羟基X罗丹明盐酸盐(ROX)通道的循环阈(Ct)值为未确定的(Undet)或Ct值大于30的样本为阴性，判定曲线为明显的S型扩增曲线且Ct值小于等于30的样本为阳性。

1.5统计学处理 应用SPSS17.0软件进行χ2检验、t检验、线性相关性分析和Kaplan-Meier生存分析。

2 结 果

2.13组Aurora-A、Aurora-B和Cath-D蛋白表达比较 观察组1、对照组1和正常对照组1 Aurora-A、Aurora-B和Cath-D表达差别有统计学意义(均P<0.05)。正常对照组1蛋白表达阳性率且显著低于对照组1，对照组1蛋白表达阳性率显著低于观察组1(均P<0.05)。见图1、表1。

Aurora-A

Aurora-B

Cath-D图1 Aurora-A、Aurora-B、Cath-D在肝细胞癌中阳性表达(DAB，×400)

表1 三组Aurora-A、Aurora-B和Cath-D阳性表达率比较〔n(%)〕

与正常对照组1比较：1)P<0.05;与对照组1比较：2)P<0.05

2.2观察组1中Aurora-A、Aurora-B和Cath-D的表达阳性率在不同临床病理特征中的比较 观察组1中Aurora-A、Aurora-B和Cath-D的表达与脉管累犯和转移显著相关，Aurora-A、Aurora-B的表达与细胞增殖指数、最大径和分化程度显著相关(均P<0.05)。见表2。

表2 观察组1中Aurora-A、 Aurora-B和Cath-D阳性率在不同临床病理特征中的比较〔n(%)〕

2.3Aurora-A、Aurora-B和Cath-D mRNA表达阳性率比较 观察组2 Aurora-A、Aurora-B和Cath-D mRNA表达的阳性率显著高于对照组2和正常对照组2，对照组2显著高于正常对照组2(均P<0.05)。见图2、表3。

Aurora-A mRNA

Aurora-B mRNA

Cath-D mRNA1：阳性曲线；2：内控曲线图2 Aurora-A、Aurora-B、Cath-D mRNA在肝细胞癌中阳性表达曲线

表3 三组Aurora-A、Aurora-B和Cath-D表达阳性率比较〔n(%),n=15〕

与正常对照组2比较：1)P<0.05;与对照组2比较：2)P<0.05

2.4观察组1中Aurora-A、Aurora-B和Cath-D相关性分析 观察组1中Aurora-A和Cath-D(r=0.41,P=0.012)、Aurora-B和Cath-D(r=0.44,P=0.031)呈显著正相关。

2.5观察组1中Aurora-A、Aurora-B和Cath-D表达的生存分析 观察组1的随访生存时间3～60个月，平均20.5个月，经生存分析显示Aurora-A(χ2=5.54,P=0.016 4)、Aurora-B(χ2=5.98,P=0.012 0)和Cath-D(χ2=4.75,P=0.025 1)的表达与生存时间显著相关(P<0.05)。即Aurora-A、Aurora-B和Cath-D高表达患者生存时间短，预后差；Aurora-A、Aurora-B和Cath-D低表达患者生存时间长，预后好。见图3～5。

图3 Aurora-A的表达与预后的关系

图4 Aurora-B的表达与预后的关系

图5 Cath-D的表达与预后的关系

3 讨 论

肝细胞癌发生时常伴有肝硬化的病史，术中观察到有肝硬化的特点，其肿块或结节常大小不一，肿瘤一般较软，易出血及出现血管浸润，边界不规则，并可见卫星结节，显微镜下可见多种形态类型，包括梁状型、腺泡型、假腺样、实性型、硬化型，不同病变类型是病理医师鉴别肿瘤的依据〔6〕。在病变形成过程中，转移相关的蛋白及增殖相关蛋白表达多为异常，对促进病变形成和进展有一定意义。Aurora激酶家族是近年来研究较多的有丝分裂蛋白激酶，它开始于DNA复制，结束于胞质的分裂，有丝分裂的发生伴随着细胞的一分为二，因此导致了细胞的分裂和各部分明显的增殖特点〔7,8〕。在分裂过程中，两极纺锤体的形成和分离、装配、排列及分裂等步骤，均需要依赖于Aurora-A、Aurora-B的作用，因此二者在细胞的有丝分裂中有重要的调节作用。Aurora-A、Aurora-B对增殖和细胞分裂的调控主要是受细胞周期蛋白(Cyclin)-A和-B来实现的〔9〕。研究认为Aurora-A、Aurora-B含有两种腺瘤样息肉病基因(APC)识别信号，一种是CyclinB降解所必需的C末端同源盒基因，一种是类似于被APC泛素化的CDC20上的N末端盒基因，该位点对阻断Aurora-A的上皮型黏附素(CDH)1依赖性破坏有一定作用〔10〕。Aurora-A可以通过诱导多种相关蛋白磷酸化来介导有丝分裂过程，即激活人参皂苷化学修饰物(PM)1和TPX2，这一过程会调节Aurora-A、Aurora-B介导磷酸化。也有观点认为Aurora-A、Aurora-B可以参与染色质的修复，常通过磷酸化组蛋白(H2AX)参与染色质的重塑实现〔11〕。Aurora-B也被认为是过客蛋白，在分裂过程的前期和中期附在着丝粒上，后期附在微管上，此时Aurora-B能使组蛋白出现明显的磷酸化，Aurora-B在细胞分裂的中期对调节染色体的分离有一定作用〔12〕。肝细胞癌是高迁移性肿瘤，其生长时易出现转移，肿瘤细胞迁移与基质金属蛋白酶(MMPs)的降解和基底膜屏障的损伤有关。Cath-D蛋白是一种溶酶体蛋白水解酶，在酸性环境中形成最多。人体组织中Cath-D的主要存在形式是34 kD的成熟稳定体〔13〕。其功能有：①作为调节肿瘤转移的相关蛋白发挥作用；②作为增生的相关促进因子，主要是通过胰岛素样生长因子(IGF)-1调控；③作为蛋白水解酶发挥溶解基底膜和细胞外基质的作用〔14〕；④释放基质破坏相关的蛋白，如MMP-2等；⑤激活Cath-B引起的级联反应〔15〕。

本实验结果显示三组中Aurora-A、Aurora-B和Cath-D的蛋白和mRNA表达的阳性率的差别有统计学意义，提示三者是引起肿瘤形成的重要基因。Aurora-A、Aurora-B和Cath-D蛋白mRNA表达有明显表达一致性。肝细胞癌发生的因素有阶段性改变，三者也具有明确的癌基因样的作用。结果显示观察组1中Aurora-A、Aurora-B和Cath-D的表达与脉管累犯和转移相关，提示三者参与肿瘤的脉管浸润和转移过程，使肿瘤细胞迁移能力增强。Aurora-A、Aurora-B的表达与细胞增殖指数和最大径有关，提示二者可以促进肿瘤的增殖和生长，使肿瘤的体积增大。观察组1中Aurora-A、Aurora-B的表达与分化程度相关，提示二者可以调节肿瘤细胞由幼稚到成熟的过程，阻止肿瘤细胞分化成熟，使其停滞在幼稚的某个阶段，细胞的异型程度明显，细胞的形态差异大，失控性增生明显。观察组1中Aurora-A和Cath-D 、Aurora-B和Cath-D 的表达具有正相关性，提示Aurora-A、Aurora-B对转移的作用可能是通过调节Cath-D实现的。Aurora-A、Aurora-B可能作为上游蛋白发挥作用，促进Cath-D分泌，产生蛋白水解和基质降解的作用。Aurora-A对P53等多个位点的丝氨酸可形成磷酸化，灭活P53，加速肿瘤的生长。Aurora-A、Aurora-B可能通过其他细胞因子等信号转导系统发挥作用，促进肿瘤的增殖和进展。在肝细胞癌的发生和进展中，癌细胞通过基因扩增、剪接和选择性启动子激活等方式分泌较多的Cath-D，此时溶酶体易位到质膜或分泌到细胞外环境，使肿瘤细胞的微环境发生改变，肿瘤细胞与基质形成互相的调节作用〔16,17〕。Aurora-A、Aurora-B高表达后可以诱导Cath-D分泌增多，这时对间质中的相关成分进行溶解，也对降解细胞外基质和基底膜有一定作用，细胞迁移的屏障受到破坏，肿瘤细胞易于离开原发灶形成播散和种植〔18〕。