青薇 黄丽娟 郑佳俊 任静 李成龙 庹嫱 任小华 牟雁东,

1.西南医科大学口腔医学院 泸州 646099；

2.电子科技大学医学院 成都 610054；

3.四川省人民医院口腔科 成都 610072

种植牙已在国内外广泛应用于牙列缺损和牙列缺失的患者，相关文献[1]报道种植体植入后的存留率高。但随着微生物黏附到种植体相关结构，菌斑控制不佳，会导致种植体周围黏膜炎和种植体周围炎，最后导致骨质流失和种植失败[2-4]。有报道[5]表明，种植体植入5～10年之后，约20%的患者和10%的植入位点发生了种植体周围炎。

龈沟液中的微生物是种植体周围龈下微生态体系中的关键成分，研究种植体周围龈下微生物多样性对于探索种植体周围炎症的发生机制有重要意义[6]。作为一种不依赖培养的分子检测技术，高通量测序具有分辨率高、重复性好等特点[7-8]。近年来，随着测序技术逐步提高和成熟，高通量测序技术得到了普遍应用，在口腔龋坏、牙周炎和种植体周围炎微生态的研究也逐步深入。种植体植入后疾病的发展是一个循序渐进的过程，菌群的定植在不同的状态下必然会有不同的体现[9-10]，基于此，笔者对于健康天然牙、健康种植体及发生种植体周围炎对象的龈沟液菌群差异进行了研究。

考虑到患者口腔内常驻微生物群的个体差异，选择在同一个体中研究种植牙健康状态向疾病状态转变时相关微生物群的变化[11]。本研究筛选出10名患者口腔内同时存在健康天然牙、健康种植体以及发生了种植体周围炎的种植体为3组研究对象，应用16S核糖体DNA（ribosomal DNA，rDNA）高通量测序技术探究3组对象的微生物多样性，以探讨龈沟液微生物菌群的差异，为种植体周围炎的精准医疗提供一定的依据。

1 材料和方法

1.1 病例资料

本实验筛选2016年1月—2018年1月就诊并接受种植义齿修复的患者，同一受试者口内至少同时存在健康天然牙、健康种植体和发生了种植体周围炎的种植体，3个月内未使用抗生素和免疫抑制类药物，1个月内未接受牙周和种植体周治疗，全身状况良好。成功种植体的纳入标准为：种植体无动度，X线片示种植体周围无透射区，垂直向骨吸收不超过种植体1/3，龈沟深度≤3 mm，探诊出血（bleeding on probing，BOP）阴性。种植体周围炎诊断如下：探诊深度（probing depth，PD）≥5 mm，BOP阳性，X线片显示种植体周围牙槽骨吸收达3个螺纹，所有受试者自愿参加并签署知情同意书。

1.2 试验材料和仪器

30#吸潮纸尖（登士柏公司，美国）；1.5 mL eppendorf（EP）管（Axygen公司，美国）；低温冰箱（青岛海尔集团）；高速台式离心机（Thermo Fisher Pico-21；Thermo Fisher Scientific公司，美国）；E.Z.A.N.Mag-Bind Soil DNA试剂盒（Omega公司，美国）；Qubit2.0 DNA检测试剂盒（Life Technologies公司，美国）；Taq DNA聚合酶（Thermo Fisher Scientific公司，美国）；SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒（上海生工生物有限公司）。

1.3 样本采集

由同一位口腔医师经技术培训后采集龈沟液。标本的采集时间均为上午（采集当日要求受试患者暂停刷牙等口腔卫生维护措施），刮除预备牙体龈缘区着色菌斑，隔湿条件下用统一规格无菌纸尖浸入颊侧近中龈沟40 s采集标本，迅速放入消毒好EP管中（收集样本时沾有血渍和被唾液污染的样本排除），做好标记，置入-80 ℃冰箱中备用。

1.4 操作方法

1.4.1 龈沟液细菌16S rDNA V1-V3基因片段多聚酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增 按照提取试剂盒相关步骤进行总DNA提取，溶解于100 μL去离子水，利用Qubit 2.0检测试剂盒对基因组DNA精确定量。

PCR所用引物已经融合了Miseq测序平台的V1-V3通用引物：V1F引物（5’ATCTGAGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’）和V3R引物（5’GAGAATTCCAACCGCGGCKGCTGGC-3’）。50 μL PCR反应体系：上游引物和下游引物各2 μL，Dream Taq PCR Master Mix 25 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min，然后进入35个循环扩增阶段，每个循环包括变性95 ℃ 40 s，退火58 ℃ 40 s，延伸72 ℃ 1 min，最后于72 ℃保温7 min。PCR结束后，引入Illumina桥式PCR兼容引物进行第2次扩增，利用Qubit2.0 DNA检测试剂盒对回收的DNA精确定量，然后按照1：1等量混合后测序。

1.4.2 龈沟液细菌16S rDNA基因测序 龈沟液微生物扩增DNA送至上海生工生物工程有限公司进行Illumina HiSeq 2500高通量测序。

1.5 生物信息学分析

利用Uparse软件对所有样品的全部有效序列（effective tag）进行聚类[12]，以97%的一致性将序列聚类成为运算分类单位（opera tional taxonomic units，OTU）；对OTU代表序列进行物种注释，用Mothur软件和GreenGene数据库进行物种注释分析（设定阈值为0.8～1.0），构建稀释曲线，利用QIIME软件计算样品Alpha多样性值[13]。

1.6 统计学方法

组间Alpha多样性两两进行独立样本t检验，菌群水平差异两两进行Wilcoxon秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者基本特征及临床检查指标

纳入实验研究对象共10名，其中男性6名，女性4名，年龄（60.1±1.7）岁；共收集30份龈沟液，分别编号为健康天然牙组（H组）、健康种植体组（HI组）以及种植体周围炎组（PI组）。患者基本特征及临床检查详见表1。

表1 患者基本特征及临床检查指标Tab 1 Characteristics of patients and clinical data

2.2 测序结果质量分析

通过对30个样品进行测序，原始序列条数为764 678；过滤掉低质量的序列后，有效序列的总数为764 230，产生1 906～3 132个OTU，有效序列比例均大于98%；质量筛查之后序列长度大部分分布在400～600 bp，平均长度均在440 bp以上，满足分析要求（图1）。从稀释曲线（图2）中可知，序列数量到1 500时，各样品稀释曲线均基本趋于平缓，说明取样合理，能够较真实地反映龈沟液样本的细菌群落。

图1 原始数据长度分布图Fig 1 Length of distribution of raw reads

图2 样本稀释曲线图Fig 2 Rarefaction curves of three groups

2.3 各样品中细菌多样性及相关性分析

3组样本的Alpha多样性指数如表2所示，Shannon指数显示H组高于PI组（P＜0.05），HI组高于PI组（P＜0.01），见图3。

图3 3组的Shannon指数差异Fig 3 Shannon indices in three groups

表2 3组样本的Alpha多样性指数Tab 2 Alpha diversity indices calculated for three groups

2.4 主成分分析

由图4可以看出，H组和HI组的主成分较类似，出现个别交叉，PI组则与H组和HI组相对独立，基本无交叉，说明PI组的菌群结构相较来说确实存在不同。

图4 主成分分析Fig 4 Principal component analysis of three groups

2.5 门水平菌群组成分析

3组样本共检测到细菌门17个，其中丰度较高的前5个门分别为：厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、梭杆菌门（Fusobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和放线菌门（Actinobacteria），具体所占比例如图5所示。PI组龈沟液中拟杆菌门占比高于H和HI组（P＜0.05）。3组之间的优势菌门对比如图6所示。

2.6 属水平菌群组成分析

在属的水平上，总共497个类群被分类，部分属热图如图7所示，可见在PI组中检出较高的有普氏菌属（Prevotella）、密螺旋体属（Treponema）、纤毛菌属（Leptotrichia）、放线菌属（Actinomyces）、链球菌属（Streptococcus）和丁酸弧菌属（Butyrivibrio）等，且与HI组和H组相应菌属丰度进行对比，差异存在统计学意义（P＜0.01），对3组相关致病菌属进行比较，具体如图8所示。

图5 样品在门分类水平上细菌类群比较Fig 5 Comparison of bacterial groups in each sample at pylum level

图6 优势菌门的比较Fig 6 Comparison of dominant bacteria in three groups

图7 属水平的热图比较Fig 7 Comparison of heatmap in three groups at genus level

3 讨论

种植体周围炎作为种植修复后最常见的并发症，是影响种植修复成败的重要因素之一，严重者甚至导致种植体脱落[14]，因此理解种植体周围组织从健康至疾病状态的复杂病因是必要的。牙周病学研究[15]发现，龈沟液量及其成分能够反映牙周炎症情况，认为龈沟液量的变化与牙周病的发展有关。龈沟液中的微生物是种植体周围龈下微生态体系中的关键成分，与种植体植入后组织健康有着密切关系。因此，在本次研究中，选择同一个体对比不同健康状态龈沟液内微生物群的转变，共纳入10名患者为研究对象。

Illumina Miseq高通量测序平台的测序原理精确、数据准确度高，用于研究复杂样品的微生物群落的组成，具有先进性[16]。在16S rRNA克隆文库法测序的结果中，总测序只有几百至一千多个克隆[17]。相比而言，高通量测序深度明显要高于变性梯度凝胶电泳 （denaturing gel gradient electrophoresis，DGGE）或16S rRNA克隆文库[18]等方法。

图8 样品在属分类水平上细菌类群比较Fig 8 Comparison of bacterial groups in each sample at genus level

Alpha多样性是指在一个特定区域或生态系统内的多样性，经常用物种丰富度来表示，其中Shannon指数反映每个物种个体数占群落中总个体数的比例，Shannon指数越大，则表示该样品中的物种多样性更高[19]。H组和HI组的Shannon指数皆显著高于PI，表明H组和HI组龈沟液中细菌的丰富度和多样性都要高于PI组，且其差异具有统计学意义（P＜0.05）；PI组细菌表现出较低的多样性，物种数量最少，这表明种植体周围炎是一种核心致病菌参与的简单感染。然而，这些核心致病菌在所有个体中并不相同，表明该疾病是微生物异质的。既往研究[20]发现，疾病状态下环境微生物群落的多样性会比健康状态下的多样性降低，这可能是因为病原微生物的聚集，从而形成核心致病群体（比如红色复合体和黄色复合体）。

在细菌门分类水平上，已知厚壁菌、拟杆菌和变形杆菌是牙周炎患者的主要龈下菌门分类[21-22]，本研究结果也证实了3个实验组中的菌群中以该3种菌门为主，其中拟杆菌门在H和HI组丰度较低，在PI组相对较高，且差异具有统计学意义。虽然变形杆菌和放线杆菌在PI组中出现了数量增高的趋势，但差异不具有统计学意义；变形菌门是革兰氏阴性菌的主要菌群之一，是龈下菌群的主要构成成分，其在疾病状态下增多，这与Koyanagi等[17]的研究结果一致。Koyanagi等[17]对比了6例种植体周围炎和牙周炎患者的龈下菌斑，表明相较于牙周组织周围，种植体周围存在更复杂的微生物组成，而且以变形杆菌为主的几种细菌是种植体周围炎的致病菌属。Kumar等[10]则指出种植体周围炎是一种以革兰氏阴性菌为主的微生物导致的感染，但致病菌种类不像牙周炎那么复杂，是一种以个别优势菌致病的简单感染。

在细菌属水平上，某些牙周炎的重要致病菌属（比如密螺旋体、普氏菌、弯曲杆菌）在本次研究中检测出为种植体周围炎的致病菌属，从某种意义上说明牙周炎和种植体周围炎的致病菌属确实相似[23]，但在本次实验中检测到种植体龈沟液中一些特殊的优势菌属（纤毛菌、变形链球菌和丁酸弧菌）。丁酸弧菌是人胃肠道中的丁酸盐生产者，其作为健康牙和种植牙共有的菌属尚未见报道，而本次研究在每个种植体龈沟液中均检测到它的存在，而且与HI组相比，这些物种的水平在PI组中更高。有趣的是，笔者还观察到丁酸弧菌与密螺旋体之间有很强的相关性（r=0.69），丁酸弧菌的代谢产物异丁酸是密螺旋体的重要生长需求，这可能提示异丁酸的增多，将会有益于密螺旋体的生长，进而促进有害菌群的增殖、聚集，促进疾病状态的发生。这一发现提示应对龈沟液内丁酸盐生产者菌属进行深入研究，探讨其致病机制及对治疗的影响。

4 结语

综上所述，本研究采用16S rDNA高通量测序研究了30例健康天然牙、健康种植体和种植体周围炎病例，共检测到包含17个门，177个科共497个属的细菌。健康种植体呈现出丰富的微生物多样性，与健康天然牙一致；而当种植体周围组织遭受致病菌引起的炎症后，表现为相关致病菌丰度增高，而其多样性下降。与此同时，种植体周围炎由于受到解剖位置及病理因素的影响，其致病相关微生物与牙周致病微生物存在联系，但仍可能有其他的致病微生物参与病变的进程。种植体周围炎优势菌属在该疾病发生、发展中的功能值得进一步深入研究。