格小光，蒋超*，田娜，魏艺聪，黄璐琦，袁媛*，刘小凡，金艳，赵玉洋

1.中国中医科学院 中药资源中心 道地药材国家重点实验室培育基地，北京 100700；2.福建中医药大学 药学院，福建 福州 350122；3.中国人民大学 统计学院，北京 100872

中药商品的基原调查是正本清源，确定真伪鉴别目标，提高中药质量标准的前提条件。地龙为临床常用的动物药材，来源于钜蚓科动物参环毛蚓PheretimaaspergillumE.Perrier、通俗环毛蚓P.vulgarisChen、威廉环毛蚓P.guillelmiMichaelsen或栉盲环毛蚓P.pectiniferaMichaelsen的干燥体[1]。前一种习称“广地龙”，后三种习称“沪地龙”。地龙属寡毛纲环毛类蚯蚓，我国此类物种极为丰富，截止到2010年，陆栖蚯蚓已达9科31属328种(含亚种)[2]，且仍存在大量环毛类新物种[3]。目前商品地龙药材多来源于野生，随着产区的增加，各地区环毛类物种均可能被采收，致使商品地龙基原极为复杂，亟需澄清。

此前的药源调查发现商品地龙基原包括参环毛蚓、通俗环毛蚓、威廉环毛蚓、栉盲环毛蚓、背暗异唇蚓AllolobophoracaliginosatrapezoidesAnt.Dugès、壮伟环毛蚓P.robusta(E.Perrier)、直隶环毛蚓P.tschiliensis(Michaelsen)、白颈环毛蚓P.californica(Kinberg，1867)、保宁环毛蚓P.magna(Chen，1938)等13种[4-5]，而地区习用地龙物种曾达3科4属49种[6]。由于各地龙物种形态近似，其内脏形态、雄孔、交配腔等主要鉴别特征在加工过程中常遭损坏，体色和表面纹理特征在干燥时常消失或发生改变，导致地龙商品基原的确定仍存在困难。

近年来随着分子系统学和生物信息学的发展，包含寡毛纲在内的动植物核酸数据库已逐步建立[7-13]。本研究对历代本草、地方志、药典标准进行了考证，以确定药用地龙物种基原，并通过细胞色素c氧化酶I基因(COI)序列分析结合形态分类对收集到的232批市售商品地龙进行基原调查，为地龙的真伪鉴定提供依据。

1 本草考证

1.1 名称考证

历代本草典籍中地龙名称的源流脉络较为清晰[14-48]。地龙原称蚯蚓，入药始见东汉年间的《神农本草经》[14]：“蚯蚓，主蛇瘕，去三虫，伏尸，鬼疰，蛊毒，杀长虫，仍自化作水。”地龙之名沿自“土龙”(南北朝·陶弘景《名医别录》[16]：“白颈蚯蚓，一名土龙，三月取，阴干”)，唐末到五代称“地龙子”(唐·梅彪《石药尔雅》[19]：“蚯蚓屎：一名龙通粉，一名蚓场土，一名地龙粉，一名寒献玉，一名土龙屎”；五代·孟贯《药性论》[22]：“蚯蚓，亦可单用，小毒。干者熬末用之，主蛇伤毒。一名地龙子”)，宋代开始以“地龙”为名入药(王怀隐《太平圣惠方》[23]：“地龙十条炙干，上捣细罗为散。夜临卧时。以冷茶调下二钱。服之”；王继先等《绍兴本草》[26]：“白颈蚯蚓，世俗呼为地龙是矣。非止白颈者可用，其实一也”)。而后历代本草中仍有沿用“蚯蚓”或“白颈蚯蚓”的名称，一直到1963年版《中华人民共和国国药典》[49](以下简称《中国药典》)将“地龙”定为蚯蚓的药材名，正式成为法定名称。

1.2 品种考证

历代本草均以具有“白颈”特征的蚯蚓为药用主流品种，但药用品种不仅来源于一个物种(表1)。宋代《图经本草》[24]及《证类本草》[25]开始部分医家将“白颈蚯蚓”和“蚯蚓”分开，并附有“蜀州白颈蚯蚓”药图，认为其“功同蚯蚓”。明·李时珍《本草纲目》[32]中“蚯蚓”和“白颈蚯蚓”为不同条目，清·汪绂《医林纂要探源》[39]则明确记载“蚯蚓一名寒蟋，一名地龙，色赤气香者可用，黑而易断如烂泥者勿用。白颈者另是一种，气味犹鲜香，治热更佳”，说明人们早就认识到地龙药材的原动物不止一种，存在着品种的差异。除“白颈蚯蚓”外，古代本草也有使用“紫项蚯蚓”的记录。宋·陈自明《妇人大全良方》[50]载：“产后癫狂，仍掘紫项活地龙一条入药，候地龙滚三滚，取出地龙不用，不令带药出，但欲得地龙身上涎耳”；宋·王璆原《是斋百一选方》[51]：“败血及邪气入心，如见祟物，癫狂。用大辰砂一、二钱，研细飞过，用饮儿乳汁三、四茶匙调湿，以紫项地龙一条入药滚三滚，刮净，去地龙不用，入无灰酒一盏，分作三、四次服”；王肯堂《证治准绳》、薛己《薛氏医案》、孙一奎《赤水元珠》中也载有此类用法，但其临床用于治疗产后癫狂，与今地龙功效不同，用法也有异。综上可知，中国地龙一直以“白颈蚯蚓”为主流入药，但由于古代本草药图图影不精确，难以反映准确的物种信息，需要结合其他信息一起进行考证。

明清以前，药用地龙没有明确的产地概念，多数本草著作均认为各处均有(表1)。对清明时期地方志进行检索，发现今北京、河北、辽宁、山东、江苏、浙江、江西、广东、海南地区所产地龙均有药用记录(表2)[52]，没有显著的地理和品种偏好性，无法考证出具体药用品种。民国以来，广地龙逐渐为大家所认可，陈仁山《药物出产辩》[44]载：“地龙以产广东顺德陈村，下滘产者为佳”，其原因可能是广东所产参状远盲蚓、保宁腔蚓等品种体型较大，且环带明显，更符合古代“入药宜大而白颈，是其老者有力”的看法。

表1 历代本草中的地龙记载

续表1

注：—表示未记载本条目内容。

表2 地方志中的地龙药用记录

2 市场调查研究

2.1 材料

2.1.1 样品 地龙药材和饮片采集于河北安国、安徽亳州、四川荷花池、广西玉林、广东清平、广东普宁、山东舜王城中药材市场，共收集样品232批。样品经上海交通大学邱江平教授进行形态学初步鉴定后经DNA测序结果进一步验证。地龙对照药材购自中国食品药品检定研究院，凭证标本保存于中国中医科学院中药资源中心，见表1。另有20种蚯蚓原动物参考样品由西南大学刘彬教授课题组提供，60种蚯蚓原动物样品由上海交通大学邱江平教授课题组提供。

2.1.2 试剂 蛋白酶K(德国默克公司，批号：1245680100)；SpeedSTAR HSTaqDNA聚合酶(大连Takara公司，批号：RR070A)；2000 bp DNA Marker(大连Takara公司，批号：D501A)；DNeasy Blood & Tissue DNA提取试剂盒(上海凯杰企业管理有限公司，批号：69506)；溴化乙锭试剂(美国Fluka公司，批号：E8751-1G)。

2.1.3 仪器 MM 400混合型碾磨仪(德国Retsch公司)；Veriti 96孔梯度PCR扩增仪(美国Applied Biosystem公司)；SYNGENE凝胶成像系统(香港GENE公司)；Nanodrop 2000微量核酸定量分析仪(美国Thermo Fisher公司)。

2.2 方法

2.2.1 DNA提取 样品除去泥土，使用70%乙醇擦拭表面，晾干。球磨粉碎，取粉末约50 mg，置洁净的2 mL离心管中，加液氮冷冻后经碾磨仪研磨至粉末，按照DNeasy Blood & Tissue DNA提取试剂盒说明书提取总DNA，采用Nanodrop 2000微量核酸定量分析仪测定其浓度，用于PCR反应或于-20 ℃保存备用。

2.2.2 PCR扩增及电泳检测 取所提取的DNA，使用COI通用引物LCO1490：5′-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3′和HCO2198：5′-TTA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3′进行PCR扩增[13]。PCR反应体系为25 μL，包含无菌双蒸水19 μL，10×FBI 缓冲液2.5 μL，dNTP(10 mmol·L-1)1.5 μL，LCO1490和HCO2198引物各0.25 μL(10 μmol·L-1)、SpeedSTAR HSTaqDNA聚合酶(5 U·μL-1)0.3 μL，DNA 模板1 μL。COI序列扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，45 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，5个循环；94 ℃变性30 s，45 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃终延伸5 min。扩增结束后取5 μL PCR产物，加入5 μL 6×Loading buffer于溴化乙锭染色的1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，SYNGENE凝胶成像系统观察。

2.2.3 测序及数据处理 取阳性扩增产物，经纯化后以对应引物进行双向测序，测序由睿博兴科生物技术有限公司完成。使用BioEdit 7.2.6软件对测序峰图和序列进行校对、去除引物序列及拼接，获得对应质量合格的DNA序列，经将数据在NCBI数据库(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)和地龙原动物数据库(上海交通大学建立)[7-9]进行BLAST比对，获得最相似物种信息。利用MEGA 6.0对获得的单倍型序列进行分析，基于Kimura-2-parameter模型计算遗传距离，使用Neighbor-Joining法构建系统发育树，并使用Bootstrap自举检验法检验各分支的支持率，Bootstrap值设定为1000次重复。

2.3 结果与分析

2.3.1 商品地龙形态分析 商品地龙药材根据体型大小、颜色和质地可明显分为4类：1)体长超过30 cm、背部棕黑色到紫黑色、刚毛粗糙的海南地龙类(海南地龙、海南山地龙)，2)体长20～30 cm、背部黄棕色到深棕色的广西地龙类(广西地龙、广地龙)，3)体长20 cm以下、背部黄色到棕色、质地较软的沪地龙类(沪地龙、河南地龙、山东地龙、小地龙)，以及4)体长20～30 cm、呈板片状、全体红棕色的进口地龙类(泰国地龙、越南地龙)(图1)。同类地龙因加工方式不同表面颜色具有差异，环带位置和形态清晰，部分样品可见背孔或雄孔，然而多数样品缺乏准确的形态鉴别特征。为确定市售地龙药材基原，本研究对所有样品的COI片段进行扩增、测序及比对分析。

注：A.泰国地龙；B.沪地龙；C.广地龙；D.海南地龙。图1 商品地龙形态

2.3.2 COI序列分析与基原鉴定 使用试剂盒提取的地龙类样品总DNA质量浓度一般为30～220 ng·μL-1。232批样品使用LCO1490/HCO2198引物扩增成功率为100%(图2)。取PCR扩增产物进行DNA测序，其中2批样品扩增产物测序失败，共计230批样品获得COI序列，去除引物区后长度均为658 bp。所获得的230条COI序列经与NCBI数据库及地龙原动物数据库进行BLAST比对，共与34种蚯蚓物种近似，含4种药典品：参环毛蚓(参状远盲蚓A.aspergillus)、通俗环毛蚓(通俗腔蚓M.vulgaris)、威廉环毛蚓(威廉腔蚓M.guillelmi)、栉盲环毛蚓(栉盲远盲蚓A.pectiniferus)[53]和30种非《中国药典》收录品种：阿美远盲蚓A.amis、多肉远盲蚓A.carnosus、皮质远盲蚓A.corticis、内栖远盲蚓A.endophilus、褐色远盲蚓A.fuscatus、优雅远盲蚓A.gracilis、海南远盲蚓A.hainanicus、异骈远盲蚓A.incongruus、毛利远盲蚓A.morrisi、暗孔远盲蚓A.octopapillatus、丘疹远盲蚓A.papulosus、壮伟远盲蚓A.robustus、缺管远盲蚓A.triastriatus、张氏远盲蚓A.zhangi、舒脉腔蚓Duplodicodrilusschmardae、安德爱胜蚓Eiseniaandrei、加州腔蚓M.californica、砺石腔蚓M.glareosa、保宁腔蚓M.magna、钩腺腔蚓M.sieboldi、直隶腔蚓M.tschiliensis、A.arenulus、A.emarcidus、A.jiriensis、A.limellus、A.phaselus、A.stricosus、M.bahli、M.birmanica。

注：泳道M为DL2000分子量标准，泳道1～34为部分市售地龙PCR扩增结果。图2 部分地龙药材COI引物扩增凝胶电泳结果

2.3.3 商品地龙基原的市场调查 基于抽检的商品地龙检测结果，从不同商品类别、不同产地、不同市场3个维度对成功获得COI 序列的230批样品进行市场调查分析(图3)。结果表明，在所收集的样品中，22%的基原物种为参环毛蚓(参状远盲蚓Amynthasaspergillum)，22%为通俗环毛蚓(通俗腔蚓Metaphirevulgaris)，稀见栉盲环毛蚓和威廉环毛蚓(<1%)；55%的市售地龙均非2015年版《中国药典》规定基原，而以保宁腔蚓M.magna为主。河北安国、安徽亳州和广西玉林是我国地龙交易的主要场所，而其他广东清平、广东普宁、四川荷花池、山东舜王城交易量较小。各市场交易的主流品种具有很大区别，安国药材市场地龙商品以广西地龙和海南地龙为主，主要基原为参环毛蚓和保宁腔蚓；安徽亳州以沪地龙和海南地龙为主，主要基原为通俗环毛蚓和保宁腔蚓；广西玉林和四川荷花池均以广地龙和广西地龙为主，主要基原为参环毛蚓。

基于COI的BLAST比对和系统发育树结果表明，商品地龙共来源于34种，各商品地龙具有相对固定的物种基原，其中海南地龙、海南山地龙主要来源于保宁腔蚓，广西地龙主要来源于参环毛蚓、保宁腔蚓，广地龙主要来源于参环毛蚓、保宁腔蚓，沪地龙主要来源于通俗环毛蚓。河南地龙、山东地龙、江苏地龙等虽然来源地不同，但基原均以通俗环毛蚓为主。

3 讨论

3.1 市售地龙基原复杂

我国药材市场市售地龙基原非常复杂，本研究测序成功样品共230批，经DNA序列分析共检出34个不同物种。此前，陈平等[5]使用形态学对我国地龙进行药源及商品调查，认为地龙原动物有13种，90%以上为正品地龙，其余主要为背暗异唇蚓、湖北环毛蚓、秉前环毛蚓等。然而本研究发现市售地龙55%为非药典品，主要品种为保宁腔蚓，未发现背暗异唇蚓、秉前环毛蚓等基原。郭利霄等[4]使用微性状对地龙进行基原鉴定，采集了3个市场13批样品，发现其混伪品来源包括保宁腔蚓、直隶腔蚓、壮伟远盲蚓、加州远盲蚓等；孙洁等[54]使用形态鉴定和DNA测序鉴定发现广地龙主要来源于参环毛蚓、保宁腔蚓和暗孔远盲蚓等3种，本研究发现市售地龙除这些来源外，还包括褐色远盲蚓A.fuscatus、优雅远盲蚓A.gracilis等30余种，表明市售地龙基原非常混乱，需要进一步澄清。

3.2 历代药用地龙并非一种

我国历代医家主流以“白颈蚯蚓”入药，而“白颈蚯蚓”并非是特定的某一属一种，而是体型较大，环带白色或类白色，膨大明显的蚯蚓物种。从地理来看，历代本草大多认为药用蚯蚓“生平土”，且“处处有之”，历代地方志中北至辽宁沈阳，南至海南琼山，西至四川成都、东至浙江扬州均有地龙的药用记录。从本草药图来看，药用地龙颜色多种，且均具有显著的环带，符合钜蚓科环毛蚓属Pheretima的特点，但均缺乏物种鉴别特征，无法判定具体药用物种。民国到建国以来逐渐认可广地龙，陈仁山《药物出产辨》[44]明确提出“蚯蚓以产广东顺德陈村，下滘产者为佳”，而同时期陈存仁认为药用蚯蚓来源于“Perichaetasieboldii或Lumbricusterrestris”，但其《中国药物标本图影》图片地龙药材体环清晰，先端膨大(图4A、B)，更类似于参环毛蚓(P.aspergillum)或保宁腔蚓的形态特征(图4C)。南京药学院《药材学》引述了陈存仁《中国药学大辞典》的观点，并进行了药源调查，认为地龙来源于“蚯蚓科小蚯蚓Perichaetasieboldii或蚯蚓Lumbricusterrestris及钜蚓科钜蚓Pheretimaasiatica等动物”，同时又认为“广地龙的干制药材，约包含秉氏蚓Pheretimapingi和参蚓P.aspergillum两种”，而后《中药志》采用了《药材学》和《中国药学大辞典》的部分观点，认为地龙来源于参环毛蚓或缟蚯蚓，但其错将参环毛蚓拉丁学名定为《中国药学大辞典》中的钜蚓Pheretimaasiatica，实际Pheretimaasiatica为直隶腔蚓Metaphiretschiliensis的异名，而非Pheretimaaspergillum。而后1963年版《中国药典》沿袭了《中药志》的做法，认为地龙来源于参环毛蚓或缟蚯蚓，也同样将参环毛蚓定为Pheretimaasiatica。1977年版《中国药典》对此进行了修订，认为地龙来源于参环毛蚓或缟蚯蚓，同时将参环毛蚓拉丁学名定为Pheretimaaspergillum。1995年版《中国药典》取消了缟蚯蚓的用药标准，同时采纳《上海市中药材标准》的做法将“沪地龙”列入，规定广地龙基原为参环毛蚓，沪地龙基原为通俗环毛蚓、威廉环毛蚓或栉盲环毛蚓，而后一直沿用至今。

注：紫色方框.来源于玉林；绿色三角形.来源于安国；土黄色菱形.来源于亳州；灰色三角形.山东舜王城；红色圆形.来源于广州清平；黄色方框.来源于四川荷花池；蓝色方框.来源于广东普宁。图3 市售地龙样品COI序列物种分析

注：A.中国药学大辞典(1935年出版)；B.中国药物标本图影(1935年编)；C.市售保宁腔蚓和参环毛蚓照片。图4 本草中的地龙图片

《中药志》认为土地龙基原为缟蚯蚓Allolobophoracaliginosa(Savigny)trapzoides，产河南中牟、山东梁山、山西等地。但缟蚯蚓Allolobophoracaliginosa为梯形流蚓Aporrectodeatrapezoides的异名，梯形流蚓是新疆、河北、北京等地的优势物种，而其环带不明显，呈半环状，形态上并非“白颈蚯蚓”。而通俗环毛蚓Pheretimavulgaris是河南中牟、山东梁山等地的优势蚯蚓，从河南、山东等地采集的地龙药材经检测均为通俗环毛蚓Pheretimavulgaris，地方志(《山东通志》《莒州志》)也表明历来有蚯蚓药用记录，1995年版《中国药典》取消了缟蚯蚓的用药标准，加入通俗环毛蚓具有合理性。

3.3 《中国药典》基原及质控的探讨

从考证结果可看出，历代药用地龙并非一种，而是所有具有“白颈”特征的环毛类蚯蚓的统称，且均缺乏准确的形态特征描述。首先，历代北至辽宁沈阳，南至海南琼山，西至四川成都、东至浙江扬州均有药用地龙的出产，而《中国药典》收载的4种地龙在很多产地并无分布。其次，自清末部分本草引入拉丁学名以来，地龙基原拉丁学名不断更替，包括Perichaetasieboldii、Lumbricusterrestri、Pheretimaaspergillum、Pheretimaasiatica、Pheretimapingi、Allolobophoracaliginosa等物种均有药用记录，难以确定药用物种的基原。此外，历版《中国药典》收载地龙基原从Pheretimaasiatica、Allolobophoracaliginosatrapzoides到Pheretimaaspergillum、Allolobophoracaliginosatrapzoides再到Pheretimaaspergillum、P.vulgaris、P.guillelmi、P.pectinifera，历经多次修订，尤其是无“白颈”的背暗异唇蚓A.caliginosatrapzoides的收载，表明中医药工作者对其基原可能难以达成共识，其基原的确定可能既有本草考证，也有资源蕴藏量和质量控制的考量。尤其是本研究结果表明，目前我国市售地龙至少来源于34个物种，而随着传统产地资源的萎缩，地龙产地扩大化，以及新地龙物种的不断发现，未来市售地龙基原可能进一步增多，目前的性状、显微、理化手段均无法准确判定市售地龙的物种基原，未来地龙的基原鉴定将更为困难。为进一步控制，可考虑引入DNA分子鉴定等准确的鉴别手段，并加大地龙养殖力度，逐渐引导用地龙向参环毛蚓等传统药用品种靠拢，从资源和检测两个角度入手解决地龙品种混乱问题。