巴桑旺堆 孙广明 洛桑顿珠 刘柳 姜南

摘要：为了解雌性牦牛乳腺中乳脂代谢与转运等现象的分子机理特征。该文提出实验方法和实验步骤，利用统计学分析研究方法，对牦牛乳脂合成和转运相关基因哺乳期表达规律进行系统性研究。结果表明，牦牛的乳脂代谢和转运基因在哺乳期的表达谱与常见奶牛具有较大差异。

关键词：牦牛;乳脂合成;基因;哺乳期

中图分类号：S823.2

文献标识码：B

doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2019.22.004

0引言

目前，有关雌性牦牛乳腺功能基因之间、外部因素与控制因素对乳腺功能基因影响等方面的研究仍然相对比较少，因此值得对雌性牦牛乳腺功能基因组实施更加深层次地探索研究。

1材料与方法

1.1材料

选取来自于云南省香格里拉藏族自治州的，5只5岁身体健康雌性牦牛作为本次试验的试验样本。利用较为常见的样品采集方式，对这5只雌性牦牛产仔前和产仔后的乳腺组织实施样本收集。

在雌性牦牛乳腺某一侧后方1/5位置收集样本。在右侧采集20、20、65以及250D的乳腺組织，左侧采集2、35、70以及140D的乳腺组织。在样本收集的过程中，用专用手术刀竖向切开2～3°Cm长度的刀口，并随之将筋膜切开，在伤口部位的两边用手施加一定压力，使乳腺产生外翻现象，然后用手术剪刀剪取大约1g雌性牦牛乳腺组织。

以单独性的方式对雌性牦牛样本采集时间点前后3d的产奶量进行测量，将平均数值作为该时间点雌性牦牛的产奶量。

1.2RNA提取及DNA、RNA合成

用电子实验称称取150mL左右的雌性牦牛乳腺组织杨蓓，在液态氮中掺入新型RNA提取剂——TRIZOL试剂，并将其均匀质化，移至离心管中。然后，向离心管中掺人三氯甲烷，其中三氯甲烷和TRIZOL试剂的比例应为1：5，将二者充分振动，待长达20s振动完成后，将离心管静置3～5min。

将TRIZOL试剂和三氯甲烷的混合型液体进行长达20min离心，移动上清液到一个新的离心管中。向离心管中掺人异丙醇，异丙醇与TRIZOL试剂的比例约为1：2，将二者混合液静置10min左右，再进行20min离心[2]。

将管中液体全部倒净，掺人纯度为80%的冷藏乙醇，乙醇和TRIZOL试剂的比例应为1：2，离心5min。将液体中的上清液去除，风干沉淀物10～15min。将已经获得的RNA样本溶解，保存在-90°C环境中以待使用。随后利用光度计对RNA样本进行浓度和纯度检验，利用电泳方式对RNA完整水平实施准确评估。同时，在实施荧光定量前，将全部RNA样本浓度全部稀释至200ng/μL。

最后应用PrimeScoriptRTAreagientKittwith cDNAEraser试剂，去掉RNA中的DNA基因组，进而合成cDNA模板。

1.3构建标准曲线

利用雌性牦牛的乳腺、肾脏、心脏、肝脏等的cDNA制作标准化曲线模板，对其进行梯度稀释，利用荧光定量仪器制作标准化曲线。每一个试管中的混合液体均为2μLcDNA、6μL预混液。在构建标准化曲线的过程中，每份样本重复3次对照性试验。利用荧光定量相关软件对荧光定量信息数据实施系统性分析，构建标准化曲线[3]。

1.4统计分析

将线粒体核糖体蛋白L39、B型细胞骨架肌动蛋白、ITGB4BP多克隆抗体作为内参基因，利用荧光定量软件对采集到的信息数据实施处理，获取标准化以后的目的基因标准差异和表达数值。随之将每种基因的5d表达数值记为“1”，其与时间点的表达数值全部除5，作为后续统计工作的基本单位。

利用SAS9.2.1版本统计软件（STATISTICALANALYSISSYSTEM）对重复测量信息实施统计分析，将其作为评估目的基因在雌性牦牛哺乳期中表达时间效应。在混合型模型中，应用最大似然估计（ML）实施系统性估计，选用符合对称作为协方差的基本结构。同时，在该模型中，将各个时间点作为固定效应，不同的雌性牦牛当做随机效应，在事后检验中（post-hoctest）使用t-检验对差异性时间点之间的显著性实施检验。此外，基因的方式表达值与整体RNA浓度与产奶总量之间相关系数应用SAS9.2.1软件计算。

2结果

2.1RNA纯度和完整性分析

利用紫外分光光度设备，对试验中提取的RNA样本实施测定。结果发现，全部样品OD280值均为1.85～2.15。利用琼脂糖凝胶电泳（Agarosegel）对RNA完整性进行鉴定，其18S和28S条带清晰度较高且明显可见，无降解现象发生。因此试验中提取的RNA样本与荧光定量PCR要求符合度较高[4]。

2.2目的基因表达变化与统计数据结果

对目的基因均改变倍数实施统计检验发现，在雌性牦牛哺乳期间，基因表达程度呈极显著性差异（P<0.01）。和15d相比，30d与60d的表达程度呈极显著性差异（P<0.01）和显著性差异（P<0.05）。而将30d与60d的表达数据对比，表达程度无明显差异（P<0.05）。对整体RNA实施统计检验发现，在雌性牦牛哺乳期间，和15d比较，在30d、60d和120d的时间点的整体RNA浓度发生明显差异（P<0.05），而此3个时间点间对比，浓度无明显差异（P<0.05）。对产奶总量实施统计检验我们发现，在雌性牦牛哺乳期力，具体产奶数量的改变呈现出极显著性的差异（P<0.01）。对所有目的基因均表达变化、整体RNA浓度以及产奶量间进行皮尔森相关性分析（Pearson correlation coefficient）发现整体RNA浓度和产奶量之间展现出正相关（r=0.762，P=0.151）;目的基因表达和产奶量明显低度，正相关（r-0.278、P=0.651），而与整体RNA浓度展现出显著性高度正相关（1=0.853、P=0.021）。

3结论

除DGAT2表达水平在达到峰值以前出现相对缓慢提高、随后出现快速下降外，别的基因表达水平在达到峰值前，均展现急速上升状态，随后出现缓慢下降情况，但总趋势在雌性牦牛进入哺乳期后，表达水平均出现显著提升。

因为牦牛自身具有特异性，同时在哺乳期，雌性牦牛基因表达水平与共调控关系等和相对常见、知名度较高的奶牛品种存在较大差异。

参考文献

[1]李亚茹，郝力壮，刘书杰，等.牦牛乳与其他哺乳动物乳常规营养成分的比较分析[J].食品工业科技，2016，37（2）：379-383，388.

[2]李亚茹，郝力壮，牛建章，等.牦牛乳与其他哺乳动物乳功能性营养成分的比较分析[J].食品科学，2016，37（7）：249-253.

[3]赵寿保，马进寿，保广才，等.半舍饲条件下淘汰母牦牛育肥及犊牦牛培育技术研究[J].畜牧与饲料科学，2019，40（7）：19-21.

[4]罗晓林，吴伟生，郝力壮，等.不同哺乳方式对牦牛公犊生长发育以及肉品质的影响[J].黑龙江畜牧兽医，2012（15）：49-51.