闫林 黄丽芳 王晓阳 孙燕 林兴军 董云萍 龙宇宙

摘要：【目的】对我国收集保存的咖啡种质资源进行遗传多样性分析，为咖啡种质资源的收集、保存、鉴定、创新及有效利用提供理论参考。【方法】从哥伦比亚大学（UBC Primer Set #9）公布的100个ISSR引物序列中筛选出多态性好、扩增条带清晰且重复性好的引物，利用其对72份咖啡种质材料进行扩增，对电泳图谱进行统计分析，并利用NTSYSpc 2.1计算遗传相似系数和遗传距离。根据非加权算术平均法（UPGMA）进行聚类分析，并进行主坐标分析。【结果】筛选出的19条引物共扩增出153条条带，其中多态性条带数为128条，占总条带数的83.7%;72份咖啡种质材料间的遗传相似系数为0.4531～0.9609，平均为0.6567;遗传距离为0.0351～1.0951，平均为0.4081。其中，大粒种种内遗传相似系数最大（0.9297～0.9531），遗传距离最小（0.0445～0.0669）;中粒种种内遗传相似系数最小（0.5781～0.8750），遗传距离最大（0.1210～0.5363）。主坐标分析与聚类分析结果一致，均显示72份咖啡种质材料可分为三大类，其中3份大粒种、3份查理种及1份中粒种巴布亚新几内亚-2聚为Ⅰ类群;32份小粒种聚为聚为Ⅱ类群;除巴布亚新几内亚-2外的其他31份中粒种及1份中小粒杂交种Arabusta和1份福建咖啡共33份聚为Ⅲ类群。聚类分析结果与种质地理来源无明显相关性。【结论】咖啡种质资源各种间存在较大的遗传差异，以中粒种种内遗传多样性较丰富，以大粒种种内遗传多样性较低。利用ISSR分子标记可准确分析咖啡资源遗传多样性。

关键词： 咖啡;ISSR;遗传多样性;聚类分析;主坐标分析

中图分类号： S571.202.4                    文献标志码： A 文章編号：2095-1191（2019）03-0491-09

0 引言

【研究意义】咖啡（Coffea spp.）主要分布在热带和亚热带地区，约有124种（Davis et al.，2006;Ceja-Navarro et al.，2015）。商业栽培主要有小粒种咖啡（C. arabica Linné）和中粒种咖啡（C. canephora Pierre）。小粒种咖啡为四倍体物种（2n=4x=44），由中粒种咖啡和C. eugenoedes或其他生态型相近的二倍体自然杂交而成（Anthony et al.，2002;Silvestrini et al.，2007;Cenci et al.，2012）。除小粒种咖啡外，其余咖啡属物种均为二倍体（Stoffelen et al.，2009;Nowak et al.，2011）。我国云南和海南等省收集保存了大量咖啡种质资源，并对其进行鉴定评价，但主要集中于形态学和抗锈性鉴定评价研究（周华等，2015;武瑞瑞等，2017），不利于后续的资源创新利用和优良品种选育研究。利用分子标记技术对咖啡种质资源进行鉴定评价，明确其亲缘关系，对咖啡种质资源利用和优良品种选育具有重要意义。【前人研究进展】ISSR分子标记兼具RAPD和SSR分子标记的优点，现已广泛应用于生物的品种鉴定（Culley and Wolfe，2001）、遗传图谱构建（易克等，2003）、遗传多样性分析（朱岩芳等，2010;张盾等，2018）、基因定位（李冬梅，2016）等研究方面，其中在咖啡种质资源遗传多样性评价方面也有广泛应用（Masumbuko and Bryngelsson，2006;Kassahun et al.，2014）。利用ISSR分子标记不仅可评价小粒种咖啡种内的遗传差异，还能有效揭示来自刚果基因库的中粒种咖啡存在遗传变异（Masumbuko and Bryngelsson，2006;Tshilenge et al.，2009）。Ruas等（2003）研究表明不同产地的8种咖啡的遗传多样性丰富，遗传相似系数为0.25～0.86。Aga等（2005）利用11个为ISSR分子标记分析来自埃塞俄比亚4个地区的咖啡种质遗传变异，结果表明不同地区群体间遗传差异较同一地区群体内遗传差异大。Kumar等（2008）利用RAPD和ISSR分子标记分析咖啡属与光花咖啡属间的基因组相似性，结果表明二者存在明显差异，且基因组相似性与地理分布存在紧密的关联性。Kassahun等（2014）利用9个ISSR引物分析埃塞俄比亚125份咖啡野生种和地方品种的遗传结构，结果表明，地方品种起源于埃塞俄比亚的不同地理区域，且以Yayu和Bonga群体遗传多样性最高，其次是Berhane Kontir群体。Motta等（2014）应用SSR和ISSR分子标记分析10个小粒种和7个中粒种咖啡的基因型特征，结果表明在种间和种内均存在明显的基因型差异。黄丽芳等（2014，2017）利用RAPD分子标记分析我国咖啡种质资源的遗传多样性和亲缘关系，结果表明种间和种内均存在明显的遗传差异，遗传多样性丰富。【本研究切入点】目前，鲜见有关利用ISSR分子标记对我国咖啡种质资源进行遗传多样性分析的研究报道。【拟解决的关键问题】利用ISSR分子标记对我国收集保存的72份咖啡种质资源进行遗传多样性分析，为咖啡种质资源的分类鉴定、有效利用及新品种选育提供理论参考。

1 材料与方法

1. 1 供试材料

72份供试咖啡种质资源基本信息见表1，其中中粒种（C. canephora Pierre）资源32份（编号7～35、58、66、67），小粒种（C. arabica. Linné）资源32份（编号36～57、60～65、69～72），查理种（C. excelsa Chevalier）资源3份（编号4～6），大粒种（C. liberica Bull ex Hiern）资源3份（编号1～3），中小粒杂交种（C. canephora Pierre×C. arabica Linné）1份（编号59），来自福建的分类不明确资源1份（编号68，下文简称福建咖啡）。编号1～67由中国热带农业科学院香料饮料研究所提供，编号68～72采自海南省澄迈县农户种植基地。ISSR引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、10×PCR Buffer和DNA Marker购自天根生化科技（北京）有限公司，其他试剂均为国产分析纯。主要仪器设备：PCR扩增仪（Bio-Rad，美国）、冷冻离心机（Hettich，德国）、超微量分光光度计（Nanodrop，美国）和全自动数码凝胶成像系统（Tanon，中国）等。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 基因组DNA提取 采摘健康植株上的无病虫害成熟叶片，液氮速冻后-80 ℃保存。利用CTAB改良法提取叶片总DNA（黄丽芳等，2011），并用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测其质量、微量分光光度计检测其浓度，用ddH2O稀释至20 ng/μL，-20 ℃保存备用。

1. 2. 2 ISSR-PCR扩增 参照闫林等（2012）的方法建立最佳ISSR-PCR反应体系及扩增程序。反应体系20.00 μL：10×PCR Buffer 2.00 μL，5 ng/μL DNA模板4.00 μL，10 mmol/L dNTPs 0.60 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.25 μL，25 mmol/L MgCl2 1.20 μL，10 μmol/L引物1.20 μL，ddH2O补足至20.00 μL。ISSR扩增程序：94 ℃预变性4 min;94 ℃ 15 s，35～50 ℃ 1 min，72 ℃ 78 s，进行40个循环;72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统上观察拍照。

1. 2. 3 引物筛选 按照优化后的最佳ISSR-PCR反应体系及扩增程序，以4份遗传背景差异较大的咖啡种质（27号、台湾小粒种、大粒种1和M10）基因组DNA为模板，利用哥伦比亚大学（UBC Primer Set #9）公布的100个ISSR引物，从中筛选出多态性好且扩增条带清晰的引物用于后续咖啡种质资源遗传多样性分析。

1. 3 统计分析

根据扩增条带在琼脂糖凝胶中迁移率的不同，统计每个样品的扩增电泳谱带。在同一遷移位置上，有条带赋值“1”，无条带赋值“0”。采用NTSYSpc 2.1计算遗传相似系数和遗传距离，根据非加权算术平均法进行聚类分析，最后基于遗传相似系数进行主坐标分析。

2 结果与分析

2. 1 多态性分析结果

从哥伦比亚大学公布的100条ISSR引物中筛选出19条扩增条带清晰、重复性高的引物，部分引物的PCR扩增结果。利用其对72份咖啡种质资源进行ISSR多态性分析，结果（表2）显示，共扩增出153条条带，大小为170～2100 bp，不同引物的扩增带数为3～14条，平均每条引物扩增8.0条条带，其中多态性条带128条，占总条带数的83.7%。

2. 2 遗传相似系数分析结果

应用NTSYSpc 2.1计算咖啡种质材料间的遗传相似系数，得到相似性矩阵。72份咖啡种质材料间的遗传相似系数为0.4531～0.9609，平均为0.6567。由表3可知，所有种质间均有不同程度的遗传差异，其中绿顶M11与福建咖啡品种遗传相似系数最小，为0.4531，表明二者遗传差异最大;CTM3（CIFC7962）与CTM19遗传相似系数最大，为0.9609，遗传差异最小，二者在形态上较相近。

不同的种内遗传相似系数差异也较大。中粒种种内遗传相似系数为0.5781～0.8750，平均为0.7250;小粒种种内遗传相似系数为0.5234～0.9609，平均为0.7961;大粒种种内遗传相似系数为0.9297～0.9531，平均为0.9427;查理种种内遗传相似系数为0.7188～0.8672，平均为0.7813。可见，中粒种遗传多样性较丰富，大粒种遗传多样性较低。

2. 3 遗传距离分析结果

应用NTSYSpc 2.1计算咖啡种质材料间的遗传距离。由表4可知，72份咖啡种质材料的遗传距离为0.0351～1.0951，平均为0.4081。其中，CTM3（CIFC7962）与CTM19的遗传距离最小，为0.0351，兴2与CTM19遗传距离为0.0413，南顶与石垄坡遗传距离为0.0445，表明二者间遗传差异较小;绿顶M11与福建咖啡遗传距离最大，为1.0951，表明二者间遗传差异较大。

中粒种种内遗传距离为0.1210～0.5363，平均为0.3029;小粒种种内遗传距离为0.0351～0.8129，平均为0.2229;大粒种种内遗传距离为0.0445～0.0669，平均为0.0543;查理种种内遗传距离为0.1387～0.3345，平均为0.2543。可见，中粒种种内遗传距离最大，遗传多样性最丰富;其次为查理种，遗传多样性也较丰富;大粒种种内遗传距离最小，遗传多样性最低。

2. 4 聚类分析结果

采用UPGMA对72份咖啡种质材料进行聚类分析。在遗传相似系数0.5927处，72份材料可分为三大类，Ⅰ类群包括来自海南文昌和兴隆的3份查理种和3份大粒种及1份中粒种巴布亚新几内亚-2，遗传相似系数为0.6484～0.9531;Ⅱ类群包括32份小粒种咖啡，遗传相似系数为0.5234～0.9609;Ⅲ类群包括31份中粒种及1份福建咖啡和1份中小粒种杂交种Arabusta，共33份资源，遗传相似系数为0.6641～0.8750。

Ⅰ类群在遗传相似系数0.7592处，南顶、石垄坡、查理小果、查理大果、大粒种1和查理中果聚为一分支，并在遗传相似系数0.6700处与巴布亚新几内亚-2聚类为一类。

Ⅱ类群在遗传相似系数0.5928处，分为2个分支，其中一支为绿顶M11，另一支为来自巴西、喀麦隆及我国台湾、云南、广西等地的32份种质。

Ⅲ类群在遗传相似系数0.6823处，越南-3种质单独成为一分支，其他32份种质在遗传相似系数0.6913外又分为两个分支，中小粒杂交种Arabusta咖啡单独为一个分支，其他来自我国海南兴隆、越南、马来西亚、泰国、印度尼西亚及巴布亚新几内亚等地的咖啡资源聚为一个分支。

综上所述，72份咖啡材料间有较高的遗传变异率，种间的差异比较明显，说明ISSR分子标记可为咖啡种质的分类研究提供更多信息。

2. 5 主坐标分析结果

基于72份咖啡种质材料的遗传相似系数矩阵进行主坐标分析。以排名前3位的矩阵特征值的贡献指数分别占49.47%、19.38%和10.01%，占总贡献的78.86%。72份咖啡种质材料分为三大簇，其中3份大粒种、3份查理种及1份中粒种（巴布亚新几内亚-2）聚为一簇;32份小粒种聚为一簇;除巴布亚新几内亚-2外的其他31份中粒种及1份中小粒杂交种Arabusta和1份福建咖啡共33份聚为一簇。主坐标分析与聚类分析结果一致，但主坐标分析比聚类分析更直观地反映各咖啡种质间的亲缘关系。

3 讨论

遗传多样性是生物多样性的基础，是重要的遗传资源。生物遗传变异均发生在分子水平，在不断进化过程中形成了丰富的遗传多样性（马克平，1993;时圣明等，2016）。我国咖啡种质大多数是从国外引进，亟需对其种质资源进行创新改良，从而选育出适合我国种植的优良品种。虽然目前我国云南和海南等地对咖啡种质资源进行收集保存，但对种质资源遗传多样性和亲缘关系等方面的研究相对较少，严重阻碍了我国咖啡遗传育种进程，进而限制咖啡产业的发展。本研究利用ISSR分子标记分析咖啡种质资源的遗传多样性，结果表明72份咖啡种质材料可分为三大类，遗传相似系数0.4531～0.9609，说明这些材料遗传背景相对较宽，存在较高的遗传多样性，与黄丽芳等（2014）的研究结果一致。Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ类群亲缘关系清晰，聚类分析结果与表型分类结果较一致，说明各种间存在较大的遗传差异，其中Ⅲ类群主要为中粒种，遗传相似系数0.6641～0.8750，说明种内遗传差异较大。这可能与中粒种咖啡是异花授粉有关，在长期的繁殖过程中形成了大量遗传变异。Hamrick和God（1990）也研究发现，多年生異花授粉植物具有较高遗传多样性，尤其在种内这种现象尤为明显。本研究还发现，Ⅱ类群的小粒种咖啡亲缘关系较紧密，遗传相似系数为0.5234～0.9609，遗传多样性较低，推测与小粒种咖啡为自花授粉有关，还可能与我国现有小粒种咖啡种质资源大多为国外引进的栽培种，而野生种质引进较少有关。Anthony等（2002）利用AFLP和SSR分子标记对26份栽培种和半野生小粒种进行遗传多样性分析，结果表明两种标记的聚类结果相似，半野生小粒种的遗传多态性比栽培种高，但总体遗传差异较小。可见，我国引进的小粒种咖啡育种亲本范围较狭窄，遗传背景相似。

前人研究发现，种质资源的遗传关系不仅与其地理来源有关，还与植物分类学特性、生长环境、功能用途等具有一定的相关性（Rotondi et al.，2003;陈海云等，2013;席春奕等，2013）。本研究的聚类分析结果表明，部分咖啡种质材料与地理来源相同或相近的种质材料聚在一起，但也有部分咖啡种质材料与地理来源不同的种质材料聚在一起，如Ⅱ类群的小粒种中，来自墨西哥的绿顶M11单独聚为一个分支，而其他来自墨西哥的小粒种材料与来自巴西、喀麦隆及我国台湾、云南、广西等小粒种材料聚为另一个分支，且该分支中台湾中部和云南贡山-2聚为一个分支，而台湾小粒种、台湾南部和云南贡山-1聚为另一个分支，说明同一产地的种质间也存在较大遗传差异，导致聚类分析结果与来源地的相关性不明显，推测是咖啡种质起源广泛、进化过程漫长及人工选育栽培共同作用的结果（Martins et al.，2007）。

4 结论

咖啡种质资源各种间存在较大的遗传差异，以中粒种种内遗传多样性较丰富，以小粒种种内遗传多样性较低。利用ISSR分子标记可准确分析咖啡资源遗传多样性。

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（責任编辑 陈 燕）