吴华莉 涂尾龙 曹建国 张莺莺 王洪洋 谈永松

摘要：【目的】明确猪杀菌性/通透性增加蛋白（BPI）基因中可能存在的SNP位点，并探讨BPI基因外显子10在上海地区5个猪群体中的多态性及其与抗病相关的优势基因型，为揭示BPI基因在仔猪腹泻抗病机制中的作用及开展猪抗病育种提供理论依据。【方法】采用在线生物信息学软件分别从碱基序列、SNP位点和蛋白氨基酸序列等角度比对分析猪BPI基因全长cDNA序列与电子克隆序列的差异，采用PCR-RFLP检测分析猪BPI基因外显子10的多态性，并检测BPI基因外显子10在杜洛克、长白、大白、申农和梅山猪群体中的基因型及基因频率。【结果】猪BPI基因电子克隆编码区（CDS）序列长度1452 bp，编码483个氨基酸，存在44个SNP位点，其中22个为同义SNP位点、22个为非同义SNP位点。猪BPI基因全长cDNA序列（EF436278.1和FJ810853.1）与电子克隆序列相比存在14处碱基差异，而对应的翻译蛋白序列存在4处氨基酸差异。猪BPI基因外显子10存在AA、BB和AB 3种基因型，各基因型在杜洛克猪、长白猪、大白猪、申农猪和梅山猪群体中的分布情况各不相同。在杜洛克猪群体中AA基因型和AB基因型呈中度多态分布（0.404和0.416），BB基因型检出比例较低（0.180）;在长白猪和申农猪群体中均未检测出AA基因型，BB基因型检出比例较高，而AB基因型检出比例较低;在大白猪和梅山猪群体中均以BB基因型检出比例较高，AB基因型次之，AA基因型检出比例最低。总体来看，除了杜洛克猪群体的A等位基因频率较高外，其他4个猪群体均以B等位基因频率较高。【结论】猪BPI基因外显子10 AA基因型频率在杜洛克猪群体中最高，在大白猪和梅山群体中较低，在长白猪和申农猪群体中未检出，即AA基因型在杜洛克猪群体中比例高与其仔猪腹泻发病率低的情况一致。因此，在大白猪和梅山猪育种过程中需提高AA基因型比例，而在长白猪和申农猪育种过程中需引进AA基因型个体，降低BB和AB基因型比例，以增加仔猪的抗病能力。

关键词： 猪;杀菌性/通透性增加蛋白（BPI）;SNP位点;基因型;多态性

中图分类号： S828.2                          文獻标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）03-0446-08

0 引言

【研究意义】断奶仔猪腹泻一直是困扰养猪业健康发展的难题，主要引起仔猪消瘦，影响其生长指标，严重者甚至引起死亡。引起仔猪腹泻原因有很多，其中大肠杆菌和沙门氏菌是最主要的病原菌（郑龙龙等，2015）。杀菌性/通透性增加蛋白（Bactericidal/permeability-increasing protein，BPI）是脂多糖结合蛋白家族成员之一，定位于胞浆颗粒细胞中，为多形核中性粒细胞（PMNs）的主要抗菌成分（Canny and Levy，2008）。BPI在机体识别和调控革兰氏阴性菌致病因子方面发挥重要作用，可中和内毒素而降低炎症反应，其功能性N端还可杀死细菌，促进中性粒细胞对细菌的吞噬作用（Akin et al.，2011）。Tuggle等（2003）研究表明，BPI基因外显子4和外显子10的多态性与猪沙门氏菌易感性有关;朱璟等（2011）研究认为，BPI基因外显子10 AA基因型可能具有较高的免疫应答能力，是提高对大肠杆菌抗性的有利基因型。因此，明确BPI基因外显子在不同猪群体中的多态性对控制仔猪腹泻具有重要意义。【前人研究进展】自Weiss等（1978）最先从PMNs中分离获得人类BPI以来，目前已从人类及猪、牛、小鼠、猕猴等哺乳动物中克隆获得BPI基因（陈薇等，1997;高恒，2008），其中，猪BPI基因定位于第17号染色体上，含有15个外显子和14个内含子（魏麟，2012）。吴正常等（2013a）通过比较13个物种的BPI基因编码区（CDS）序列，结果发现除猕猴外，人类及猪、鼠等动物均具有BPI1和BPI2两种保守的结构域。人类与猪的BPI已被证实具有中和内毒素及抗革兰氏阴性菌的作用（周红等，1999;Levy et al.，2003）。此外，Tuggle等（2003）检测到BPI基因外显子4和外显子10分别存在AvaⅡ和HPaⅡ酶切多态性，其基因型与猪沙门氏菌的易感性有关，即BPI基因为抗病育种候选基因。袁树楷（2007）研究发现，荣昌猪BPI基因外显子3第397位存在的碱基突变（G→A），引起氨基酸由精氨酸（Arg）替换为谷氨酸（Gln），且该突变位点可能对荣昌猪BPI蛋白功能及机体天然免疫力有重要影响;而荣昌猪BPI基因外显子4存在4个SNP位点（T512C、G551T、C563T和G599A），说明该片段具有较大的遗传选择潜力。陈平（2015）研究证实，猪源BPI N端不仅能杀灭大肠杆菌、沙门氏菌等革兰氏阴性菌，还对L-型化脓链球菌等革兰氏阳性菌具有抗菌活性。吴正常等（2015）通过筛选靶向干扰猪BPI基因表达的siRNA，以期从细胞水平研究BPI基因对猪肠道革兰氏阴性菌抗感染的作用机制。Bülow等（2018）研究发现，BPI通过结合革兰氏阳性菌的脂肽、脂蛋白及脂磷壁酸而产生杀菌作用。【本研究切入点】目前，在猪场生产实践中发现长白猪及其培育品种申农猪的仔猪腹泻发病率较高，但是否与BPI基因外显子多态性差异有关尚有待进一步探究。【拟解决的关键问题】通过分析猪BPI基因序列信息寻找可能存在变异位点（SNP位点），并检测分析BPI基因外显子10在上海地区5个猪群体中的多态性及其与抗病相关的优势基因型，为揭示BPI基因在仔猪腹泻抗病机制中的作用及开展猪抗病育种提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试的5个猪群体样品中，杜洛克猪（89头）、大白猪（154头）和长白猪（79头）由上海祥欣畜禽有限公司提供，梅山猪（130头）由上海猪状元畜牧综合场提供，申农猪（75头）由上海警备区富民农场提供，共计527头，所取样品均为猪耳组织。所采样品置于预先添加75%酒精的1.5 mL离心管中，以冰盒保存带回实验室，-20 ℃保存备用。同时从NCBI网站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/100286800）下载猪BPI基因的4条电子克隆序列和2条全长cDNA克隆序列，具体信息如表1所示。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 生物软件分析 采用BioEdit、Lasergene和DNAMAN对下载的6条BPI基因序列进行比对分析，选取共有的CDS序列，其长度为1452 bp;同时对其编码蛋白氨基酸序列进行比对分析。

1. 2. 2 DNA提取 采用AXYGEN组织DNA提取试剂盒提取猪耳组织基因组DNA，并稀释至30 ng/mL， -20 ℃保存备用。

1. 2. 3 引物设计合成及PCR扩增 参照朱璟等（2011）的方法设计扩增引物（上游引物：5'-CCCAAC ATGGAGATGCAGTTC-3';下游引物：5'-CAATGAA TCAATGAGCACACC-3'），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反应体系50.0 μL：Master Mix 25.0 μL，BPI-F和BPI-R各1.0 μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O 22.0 μL。扩增程序：94 ℃预变性5 min;94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，进行30个循环;72 ℃延伸5 min。PCR产物采用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1. 2. 4 PCR-RFLP检测 PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后进行酶切，酶切体系16.0 μL： PCR扩增产物4.0 μL，10×Buffer 2.0 μL，HpaⅡ酶0.5 μL，ddH2O 9.5 μL;酶切时间约30 min。

1. 2. 5 基因型分析 PCR扩增获得的目的基因片段存在HpaⅡ酶切位点，采用内切酶HpaⅡ进行酶切后可产生3种基因型：AA型（445 bp）、BB型（304和142 bp）和AB型（445、304和142 bp）。根据酶切结果，不同基因型分别选取3个样品进行测序。

1. 2. 6 基因型频率和基因频率计算 等位基因是指位于一对同源染色体相同位置上控制着相对性状的一对基因，以A和B表示。依据群体遗传学计算公式，分别计算等位基因频率及其基因型频率（王旭等，2017;王利平等，2018）。

2 结果与分析

2. 1 猪BPI基因CDS序列分析结果

猪BPI基因CDS序列长度1452 bp，编码483个氨基酸，其信号肽区域长度为27个氨基酸（第1～27位氨基酸），功能区BPI1长度为226个氨基酸（第35～260位氨基酸），功能区BPI2长度为204个氨基酸（第275～478位氨基酸）。根据NCBI提供的SNP GeneView信息可知，猪BPI基因CDS序列存在44个SNPs位点，其中22个为同义SNP位点、22个为非同义SNP位点。

2. 2 猪BPI基因电子克隆序列与全长cDNA序列的SNP位点比对分析结果

DANMAN分析结果显示，猪BPI基因全长cDNA序列（EF436278.1和FJ810853.1）与电子克隆序列相比存在14处碱基差异，具体信息表2。其中，4条电子克隆序列完全一致。从NCBI数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/100286800）下载猪BPI基因DNA序列（NC_010459），然后根据其序列特征划分BPI基因外显子区域，15个外显子长度分别为130、115、129、162、64、64、92、177、60、168、68、43、64、77和39 bp。电子克隆序列与全长cDNA序列的碱基差异分别位于：外显子2（C401T）、外显子3（A505G）、外显子4（C582T、G607C、C615T、T654G、C666T和G702A）、外显子6（C855T）、外显子7（C925T）、外显子8（G1005T）、外显子10（A1258G）、外显子13（T1533C）和外显子15（C1647T）。

2. 3 猪BPI基因电子克隆蛋白序列与全长cDNA翻译蛋白序列比对分析结果

猪BPI基因全长cDNA翻译蛋白序列与电子克隆蛋白序列存在4处氨基酸差异，分别是第118位精氨酸突变为谷氨酰胺（Arg→Gln）、第154位精氨酸突变为甘氨酸（Arg→Gly）、第260位苏氨酸突变为丝氨酸（Thr→Ser）和第371位丙氨酸突变为苏氨酸（Ala→Thr）。其中，BPI1区域有3处氨基酸差异，BPI2区域仅有1处氨基酸差异。

2. 4 猪BPI基因PCR扩增结果

采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，结果发现目的基因条带大小为445 bp，且目的条带单一明亮、无杂带，符合后续的酶切要求。

2. 5 猪BPI基因测序结果

猪BPI基因PCR扩增产物测序结果，其序列中存在Hap II酶切位点（C/CGG），在测序结果中以加粗下划线标注酶切位点位置。

2. 6 各基因型测序分析结果

根据Hap II酶切电泳结果，3种基因型各选择3个样品进行测序。AA基因型突变位点处碱基为T时未形成Hap II（C/CGG）酶切位点，酶切后PCR片段长度不变，仍为445 bp;BB基因型突变位点处碱基为G时形成Hap II（C/CGG）酶切位点，酶切后PCR片段被分为304和142 bp 2个片段;AB基因型为杂合子，酶切后PCR片段被分为445、304和142 bp 3个片段。

2. 7 PCR-RFLP检测结果

采用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测Hap II酶切结果，结果显示获得的目的条带与预期结果一致。其中，AA基因型为1条条带，BB基因型为2条条带，AB基因型为3条条带。说明待检测样品存在BPI基因外显子10的3种基因型。当突变位点为T时未产生酶切位点，酶切产物长度445 bp;当突变位点为G时产生酶切位点，酶切产物长度为304和142 bp;当突变位點为T/G杂合子时，酶切产物长度分别为445、304和142 bp。

2. 8 BPI基因外顯子10在5个猪群体中的基因型及基因频率

由表3可知，BPI基因外显子10在杜洛克猪、长白猪、大白猪、申农猪和梅山猪群体中各基因型的分布情况各不相同。在杜洛克猪群体中AA和AB基因型呈中度多态分布，BB基因型检出比例较低;在长白猪和申农猪群体中均未检测出AA基因型，BB基因型检出比例较高，而AB基因型检出比例较低;在大白猪和梅山猪群体中均以BB基因型检出比例较高，AB基因型次之，AA基因型检出比例最低。总体来看，除了杜洛克猪群体的A等位基因频率较高外，其他4个猪群体均以B等位基因频率较高。

3 讨论

BPI存在于多形核中性粒细胞（PMNs）中，能中和细菌释放的脂多糖（LPS），并可激活磷脂，增强细胞膜通透性，导致细菌死亡，尤其对革兰氏阴性菌具有广泛的杀灭作用，在机体体内被称为超级抗生素（朱璟，2012）。BPI的N端与病原菌LPS结合，而C端结合于吞噬细胞表面，增强中性粒细胞对细菌的吞噬作用（Nishimura et al.，2001;高恒等，2009）。本研究通过分析NCBI上已公布的猪BPI基因序列，发现其全长cDNA克隆序列与电子克隆序列相比存在14处碱基差异，分别位于：外显子2（C401T）、外显子3（A505G）、外显子4（C582T、G607C、C615T、T654G、C666T和G702A）、外显子6（C855T）、外显子7（C925T）、外显子8（G1005T）、外显子10（A1258G）、外显子13（T1533C）和外显子15（C1647T）;而对应的翻译蛋白序列存在4处氨基酸差异，分别是第118位Arg→Gln、第154位Arg→Gly、第260位Thr→Ser和第371位Ala→Thr。由于电子克隆序列是利用生物信息学技术组装延伸ESTs序列所获得，因此需采用全长cDNA克隆加以验证。二者间存在的差异可能是突变位点所引起，其中在外显子4上存在6处碱基差异和4个SNPs位点，与袁树楷（2007）的研究结果一致，其余SNP位点则需在不同猪种群体进行差异位点检测分析，以确定其遗传变异规律。

目前，已有研究报道猪BPI基因外显子1、外显子3、外显子4和外显子10均存在SNP位点，且证实外显子4和外显子10的多态性与沙门氏菌易感性相关（袁树楷，2007;曹晓华，2008;吴正常等，2013b;Wu et al.，2015）。朱璟等（2011）研究发现，猪BPI基因外显子10 AA基因型是有利基因型，对大肠杆菌F18菌株的抗性显著或极显著高于AB和BB基因型个体，且证实这种抗性与猪BPI基因在空肠和十二指肠上调表达有关。本研究结果显示，BPI基因外显子10 AA基因型在外来猪种（杜洛克）群体中的比例较高，在地方品种（梅山猪）和大白猪群体中的比例较低，而在长白猪和申农猪群体中均未检测出AA基因型，与朱璟（2012）的研究结果一致。申农猪是由长白×（大白×二花脸）经横交固定、世代选育形成的母本新品系，其特点是耐粗饲、母猪体型较小、耗料较少、饲养管理要求不高。以其为母本、大白猪为父本杂交获得的子代在生长指标、肉色、肌内脂肪等方面均优于亲本（胡志刚等，2010;谈永松等，2011），但该杂交品系在育种过程中常遇仔猪腹泻频发的问题，是否与BPI基因外显子10 AA基因型在检测群体中缺失有关还有待进一步探究。

本研究通过检测猪BPI基因在5个猪群体的遗传变异情况，一方面可寻找疾病易感基因型的遗传标记应用于育种实践，对提高猪的经济价值具有重要意义;另一方面，基因型分布可反映猪群体遗传结构稳定。因此，在申农猪育种过程中应重点关注BPI基因外显子10 AA基因型比例的增加情况。此外，需进一步结合5个猪群体的仔猪腹泻情况进行相关分析，从而判定仔猪腹泻与猪BPI基因外显子10基因型是否相关，并确定是否还存在控制疾病发生发展的其他协同基因。

4 结论

猪BPI基因外显子10存在AA、BB和AB 3种基因型，AA基因型频率在杜洛克猪群体中最高，在大白猪和梅山群体中较低，在长白猪和申农猪群体中未检出，即AA基因型在杜洛克猪群体中比例高与其仔猪腹泻发病率低的情况一致。因此，在大白猪和梅山猪育种过程中需提高AA基因型比例，而在长白猪和申农猪育种过程中需引进AA基因型个体，降低BB和AB基因型比例，以增加仔猪的抗病能力。

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（责任编辑 兰宗宝）