李萌　马致洁　章从恩　章前　于卫东　陈熹　赵奎君

摘要 目的：優化构建抗抑郁研究的细胞实验模型，探讨西红花对皮质酮（CORT）诱导的PC12细胞损伤的保护作用及其相关机制。方法：观察不同浓度（0、125、250、500、750、1 000 μmol/L）皮质酮损伤PC12细胞24 h、36 h、48 h，CCK-8检测细胞活力，优化构建抑郁体外模型;不同浓度（2.5、5、10 μg/mL）西红花预处理PC12细胞24 h，CCK-8检测细胞活力，观察西红花对CORT（500 μmol/L）细胞损伤后的保护作用;检测细胞培养上清中的LDH活性，判断药物对细胞膜的保护作用;使用Annexin V-FITC/PI双染色法检测药物对CORT诱导的PC12细胞凋亡的保护作用;检测细胞裂解液中Caspase-3活性，判断药物作用与Caspase蛋白通路相关性。结果：CORT（0～1 000 μmol/L）作用PC12细胞，细胞存活率随药物浓度的增加而逐渐降低，依剂量呈线性关系;当西红花浓度>100 μg/mL时，对PC12细胞存活的影响出现统计学意义;西红花预处理后，细胞存活率由模型组（53.31±4.18）%，上升为（57.46±2.76）%、（60.48±2.73）%、（61.99±3.05）%、（61.38±2.26）%、（59.46±2.41）%、（58.64±3.74）%;西红花预处理组LDH释放量显著低于模型组（P<0.05）;西红花能够明显抑制CORT诱导的PC12细胞凋亡，西红花可抑制Caspase-3的表达。结论：西红花对CORT诱导的PC12细胞有一定保护作用。

关键词 西红花;皮质酮;PC12细胞;诱导;细胞损伤;模型;抑郁

Protective Effects of the Crocus sativus L on CORT Induced PC12 Cell Injury

Li Meng1，Ma Zhijie1，Zhang Congen1，Zhang Qian2，Yu Weidong3，Chen Xi1，Zhao Kuijun1

（1 Department of Chinese Pharmacy，Beijing Friendship Hospital，Capital Medical University，Beijing 100050，China; 2 Beijing Keyuan Xinhai Pharmaceutical Business Co.，Ltd.，Beijing 100160，China; 3 Shanghai Traditional Chinese Medicine Co.，Ltd.，Shanghai 200002，China）

Abstract Objective：To optimized the establishment of a model of depression in vitro，and to explore the protective effects of Crocus sativus L on PC12 cell injury induced by CORT and its related mechanisms.Methods：PC 12 cells were treated with CORT in different concentrations （0，125，250，500，750 and 1 000 μmol/mL） for 24，36 and 48 h to establish a depression model in vitro.PC12 cells were pretreated with Crocus sativus L at different concentrations （2.5，5 and 10 ug/mL） for 24 hours.Cell viability was measured by CCK-8，and the protective effects of Crocus sativus L on PC12 cell injury induced by CORT were determined.The levels of LDH activity in supernatant were detected to judge the protection effect of the drugs on PC12 cells.The protective effect on PC12 apoptosis was analyzed by Annexin V-FITC/PI staining.Caspase-3 activity was detected in cell lysates and correlation between drug action and Caspase protein pathway was judged.Results：After CORT （0-1 000 μmol/L） treatment of PC12 cells for 24 h，the cell survival rates of each concentration were decreased with dose increasing in a dose-dependent manner.When the concentration of Crocus sativus Lextract was greater than 100 μg/mL，the effect on PC12 cells was statistically significant.After drug pretreatment，the PC12 cells survival rate was increased from model group （53.31±4.18）% to （57.46±2.76）%，（60.48±2.73）%，（61.99±3.05）%，（61.38±2.26）%，（59.46±2.41）% and （58.64±3.74）%，respectively.The release of LDH from Crocus sativus L pretreated group was significantly lower than that of model group （P<0.05）.Crocus sativus L can significantly inhibit CORT-induced apoptosis of PC12 cells.Crocus sativus Lcan inhibit the expression of Caspase-3.Conclusion：Crocus sativus L has the protective effects on PC12 cell injury induced by CORT.

Key Words Crocus sativus L; Corticosterone （CORT）; PC12 cells; Induced; Cell injury; Model; Depression

中图分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.04.009

抑郁症，以持久而显著的心境和情绪低落为主要临床表现，是心境障碍的主要类型[1]。抑郁症患者除情绪低落外，至少包含2种以上其他症状，包括失眠或嗜睡、易疲劳、饮食量改变以及出现自卑或绝望感等[2]。如不加以控制，会发展为更为严重的如双向情感障碍等疾病，又因其不易被发现且病情绵长的特点导致抑郁症的治疗成为临床的难点[3]。目前临床治疗抑郁症的首选药物为是五羟色胺再摄取抑制剂（SSRIs），例如西酞普兰、舍曲林和氟西汀等，但药物的有效性不足六成，且起效时间平均需要6-8周[4]。与此同时，SSRIs的不良反应较多，例如患者骨折风险增加、出现静坐不能和性功能障碍以及自杀倾向等较为严重的病症[5]。因此有效且不良反应小的抗抑郁症药物的研发有着重要意义。

《本草纲目》中记载，西红花（Crocus sativus L.）为鸢尾科番红花属植物的干燥柱头，可“主心忧郁积，气闷不散，活血，久服令人心喜”[6]。现代中医在临床使用中发现，西红花可以治疗和预防神经退行性疾病等。因此西红花治疗异常心理状态或行为的疗效逐渐被人们关注[7]。目前，有部分实验发现西红花具有抗抑郁的药效，但在细胞水平的研究成果较少。本研究使用皮质酮（CORT）作用于低分化PC12细胞，建立抑郁症体外模型。通过观察西红花对PC12细胞的保护作用，探讨药物的细胞保护和抗凋亡作用，为西红花对抑郁症的防治提供进一步的研究依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 PC12细胞（购买自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所）用含10%的胎牛血清，1%青链霉素的RPMI 1640培养基，37 ℃、5%CO2培养箱中培养，隔天换液，2～3 d传代，取对数生长期细胞进行实验。

1.1.2 药物 西红花（上海药材公司，批号：16120530）由首都医科大学附属北京友谊医院赵奎君教授鉴定为鸢尾科番红花属西红花Crocus sativus L.的干燥柱头;皮质酮（Corticosterone）（美国Sigma公司，批号：BCBP9232V）。

1.1.3 试剂与仪器

胎牛血清（美国HyClone公司，批号：1624110）;RPMI Medium 1640 basic（1×）培养基（美国gibco公司，批号：8118083）;青链霉素混合液（北京Solarbio科技有限公司，批号：68045655）;磷酸缓冲盐溶液（PBS）（美国HyClone公司，批号：AD17628286）;0.25%胰蛋白酶溶液（美国gibco公司，批号：1928609）;CCK-8（日本Dojindo Lab公司，货号53445）;二甲基亚砜（DMSO）（美国Sigma公司，批号：11381217）;乳酸脱氢酶试剂盒（LDH）（南京建成生物工程研究所，批号：446553）;Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（碧云天生物技术研究所，批号：748957）;Caspase-3活性检测试剂盒（碧云天生物技术研究所，批号：C1116）。

生物安全柜（美国Nuaire公司，型号：Labgard NV-425-400s）;CO2细胞培养箱（美国Nuaire公司，型号：NV-5510E）;倒置生物显微镜（德国Leica公司，型号：Leica DMi1）;离心机（北京白洋离心机厂，型号：400C）;酶标仪（美国Molecular Device公司，型号：SpectraMax M3）;荧光显微镜（德国Leica公司，型号：DMI3000B）;细胞计数仪（美国Bio-rad公司，型号：TC20）;小型冷冻高速离心机离心机（德国Eppendorf公司，型号：5424R）;超纯水机（美国Millipore公司，型号：Milli-Q）;电子天平（赛多利斯科学仪器公司，型号：BSA224S-CW）;超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，型號：KQ3200E）;-80 ℃医用低温冰箱[日本SANYO公司，型号：MDF-382E（N）];恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司，型号：DK-99-ll）。

1.2 方法

1.2.1 分组与药物制备

1.2.1.1 CORT损伤模型构建分组 1）正常对照组（NC）：含1%胎牛血清培养基培养，不做其他处理2）CORT模型组：100 μL含CORT浓度为：0、125、250、500、750、1 000 μmol/L的1%胎牛血清培养液，分别处理24、36、48 h。处理结束，检测细胞存活率[8]。

1.2.1.2 西红花毒性剂量筛选分组 1）正常对照组（NC）：含1%胎牛血清培养基培养，不做其他处理2）西红花组：西红花储备液用1%胎牛血清培养基配置不同浓度（此浓度为折算后的西红花药材浓度，简称西红花浓度）：10、50、100、150、200 μg/mL，培养24 h，检测细胞存活率。

1.2.1.3 西红花给药分组 1）正常对照组（NC）：含1%胎牛血清培养基培养，不做其他处理2）CORT损伤模型组（M）：500 μmol/L CORT处理3）西红花给药组：含1%胎牛血清培养基稀释西红花储备液至不同浓度（1.25、2.5、5、10、20、40 μg/mL），均预给药24 h，之后加入500 μmol/L CORT处理24 h，结束后检测细胞存活率。根据实验结果选择低、中、高剂量组（简写为CL、CM、CH）。以下实验均按该分组方式处理，收集细胞或培养上清进行后续实验。

1.2.1.4 药物制备 称量34.6 mg CORT溶于1 mL DMSO溶液中，制成浓度为100 mmol/L的储备液备用。称量1 g西红花药材，粉碎后加入10 mL 75%乙醇超声提取2 h，过滤，4 ℃放置一晚，浓缩后冷冻干燥，得提取物0.5 g，计算提取率约50%。西红花提取物溶于水中，配置成2 mg/mL西红花原药材储备液，4 ℃存储备用。

1.2.2 检测指標与方法

1.2.2.1 CCK-8细胞存活率检测 取对数生长期PC12细胞以2×104个/孔接种于96孔细胞培养板中，每孔加入100 μL完全培养基，生长24 h，之后按照不同实验分组进行处理，处理完成后，每孔加入10 μL的CCK-8，并设置空白对照，37 ℃孵育90 min后，在酶标仪450 nm波长下读取吸光度。每组实验设置6个复孔，每个实验重复3次。按照公式计算细胞存活率：细胞存活率（%）=（实验组-空白对照组）/（对照组-空白对照组）×100%[9]。

1.2.2.2 细胞形态观察 PC12细胞经造模给药处理后，于倒置显微镜下观察各组细胞形态学变化。

1.2.2.3 乳酸脱氢酶（LDH）活性检测 以5×105个/孔细胞向6孔细胞培养板接种PC12细胞，培养24 h后，按照1.2.1.3中试验方法分组处理后，收集上清液，1 000 r/min离心5 min，进行乳酸脱氢酶测定，方法参照说明书。

1.2.2.4 Annexin V-FITC细胞凋亡检测 以5×105个/孔细胞向6孔细胞培养板接种PC12细胞，培养24 h后，按照1.2.1.3中试验方法分组处理后，进行Annexin V-FITC细胞凋亡检测，方法参照试剂盒说明书，在荧光显微镜下观察实验结果。

LDH活性（U/L）=测定值-对照值标准值-空白值×标准品浓度×1 000

1.2.2.5 Caspase-3活性检测 以5×105个/孔细胞向6孔细胞培养板接种PC12细胞，培养24 h后，按照1.2.1.3中试验方法分组处理后，进行Caspase-3活性检测，方法参照试剂盒说明书。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件对实验数据进行分析，计量资料用均数±标准差表示，采用单因素方差分析对数据进行分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CORT损伤模型的选择 采用CCK-8检测细胞存活率，结果如图1所示，不同浓度（0、125、250、500、750、1 000 μmol/L）CORT处理PC12细胞24 h后，细胞存活率分别是（100.00±1.37）%、（80.77±2.65）%、（76.94±1.60）%、（49.54±1.82）%、（36.71±2.14）%、（15.54±4.00）%，处理36 h后，细胞存活率分别是（100.00±1.76）%、（69.36±1.32）%、（55.92±1.25）%、（46.71±2.44）%、（14.84±0.94）%、（1.53±0.32）%处理48 h后细胞存活率分别是（100.00±7.73）%、（56.93±5.21）%、（56.15±6.11）%、（44.26±5.20）%、（18.24±2.05）%、（0.70±0.83）%，细胞存活率随药物浓度的增加而逐渐降低，依剂量呈线性关系。500 μmol/L CORT处理PC12细胞24 h后，细胞存活率下降到（49.54±1.82）%（P<0.01），引起约半数的PC12细胞死亡，根据实验结果选择浓度500 μmol/L处理24 h为本实验的损伤模型。

2.2 西红花毒性剂量 不同浓度西红花处理细胞24 h后，CCK-8检测细胞存活率为（100±6.18）%、（101.56±5.22）%、（96.37±4.58）%、（94.51±4.01）%、（94.05±2.96）%、（93.50±3.52）%。经统计学分析，当西红花浓度大于100 μg/mL时，差异有统计学意义（P<0.05，图2），表明对细胞的存活有影响，因此选择西红花的浓度应小于100 μg/mL。

2.3 西红花的细胞保护作用 不同浓度西红花预处理细胞24 h后，加入500 μmol/L CORT作用24 h，细胞存活率由模型组（53.31±4.18）%，上升为（57.46±2.76）%、（60.48±2.73）%、（61.99±3.05）%、（61.38±2.26）%、（59.46±2.41）%、（58.64±3.74）%。结果提示，西红花对CORT引起的损伤具有保护作用，其中2.5 μg/mL、5 μg/mL和10 μg/mL时，细胞保护作用有统计学意义（P<0.05，图3）。根据实验结果，选用2.5 μg/mL、5 μg/mL和10 μg/mL作为西红花处理的低（CL）、中（CM）、高（CH）剂量浓度，用于后续实验分组[10]。

2.4 细胞形态学观察 倒置显微镜下观察PC12细胞，呈圆形、椭圆形或多角形，有的可见突触，贴壁生长，折光性强。经CORT处理后，细胞突触收缩，细胞膜粗糙，折光性下降，贴壁状态差甚至漂浮死亡。西红花提取物处理组可见细胞损伤减弱，活细胞增多。见图4。

2.5 LDH活性 LDH广泛存在于细胞中，当细胞膜受损伤后，胞质中的LDH释放到培养基中，通过检测细胞培养基中的LDH活性可以反映细胞的损伤程度[11]。本实验正常组LDH活性为（245.39±22.35）U/L，模型组为（439.30±32.03）U/L，CL组为（421.63±20.41）U/L，CM组为（394.67±8.96）U/L，CH组为（348.95±28.57）U/L。测定结果显示，CORT损伤组与对照组比，LDH活性显著升高（**P<0.01）;药物保护组与模型组比显著降低（△P<0.05）。见图5。

2.6 Annexin V-FITC细胞凋亡检测 通过Annexin V-FITC/PI双染色法，使用荧光显微镜对凋亡细胞进行形态学观察，结果如图6所示。图中绿色荧光为Annexin V-FITC染色阳性细胞，红色荧光为PI染色阳性细胞。仅被绿色荧光染色的为凋亡细胞，被绿色和红色荧光双染的是坏死细胞，未被荧光染色的为正常细胞。NC组Annexin V-FITC荧光强度非常弱，表明PC12細胞处于正常状态;模型组荧光强度明高于NC组，表明CORT诱导的PC12细胞发生明显的细胞凋亡以及细胞死亡。CL、CM以及CH组荧光强度逐渐降低，细胞凋亡及坏死细胞的数量明显下降，表明西红花能够较为有效的抑制CORT诱导的PC12细胞凋亡。

2.7 Caspase-3活性检测 Caspase是一个在细胞凋亡过程中起重要作用的蛋白酶家族，Caspase-3是其中一个关键酶，其介导的蛋白剪切是细胞凋亡分子机制的重要组成部分。通过检测细胞裂解液中的Caspase-3活性可以反映细胞凋亡程度。本实验结果正常组Caspase-3活性为（7.05±0.12）μmol/L，模型组为（15.48±0.48）μmol/L，CL组为（10.86±0.79）μmol/L，CM组为（8.90±0.15）μmol/L，CH组为（7.62±0.83）μmol/L。测定结果显示，CORT损伤组与对照组比，Caspase-3活性显著升高（**P<0.01）;药物保护组与模型组比显著降低（△P<0.05），结果见图7。

3 讨论

西红花的主要成分为西红花苷-I、藏花醛和山柰酚等[12]。研究表明，其具有抗氧化活性和神经保护作用[13]。并且有Meta分析得出结论，补充服用西红花可以改善轻度至中度抑郁症患者的临床症状[14]。但其起效的生物过程和细胞体外抑郁模型的保护作用及机制尚不明确。因此，在本研究中，我们使用CORT诱导PC12细胞损伤，构建抑郁症体外模型，通过检测细胞存活率、LDH释放率、Annexin V-FITC/PI双染色法和Caspase-3活性，探讨西红花对CORT致PC12细胞损伤的保护作用。

PC12细胞来源于大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤细胞，具有类似于神经细胞的一般特征[15]。由于PC12细胞具有易获取、可传代、增殖迅速等优点，使其在抑郁症研究中应用广泛[16]。CORT是一种糖皮质激素（Glucocorticoids，GC），是HPA轴（Hypothalamic-pituitary-gonadal，HPA）的终末产物，CORT浓度增加可导致神经细胞损伤，产生抑郁样行为[17]。因此高浓度CORT诱导PC12细胞损伤模型广泛应用于抑郁的体外实验中。本实验观察到，CORT对PC12细胞有明显的损伤作用，呈剂量依赖性。500 μmol/L CORT损伤24 h，细胞存活率下降到（49.54±1.82）%，且稳定可重复，因此选用此浓度作为该实验损伤模型。2.5 μg/mL、5 μg/mL和10 μg/mL西红花预处理细胞，造模后检测细胞存活率，分别为（60.48±2.73）%、（61.99±3.05）%、（61.38±2.26）%，差异有统计学意义，因此选为药物保护的模型浓度。

本研究探讨了西红花对CORT诱导的PC12细胞损伤的保护作用，结果表明，西红花可提高损伤后细胞的存活率，减少细胞膜损伤的LDH释放量，且能够明显减少PC12细胞凋亡及死亡数量。通过倒置显微镜和Annexin V-FITC/PI双染色法于荧光显微镜下观察，CORT造模后，PC12细胞出现突触收缩、折光性差、细胞膜粗糙等损伤及凋亡典型特征，加入西红花处理后，其上述特征及凋亡荧光明显减少。说明了西红花对PC12细胞的凋亡具有一定的改善作用。Caspase-3是凋亡领域研究的热点，它是凋亡蛋白酶级联反应的最终通路，活化的Caspase-3切割下游相应的胞质胞核底物导致细胞凋亡从而发挥促凋亡作用。当受到外界刺激时，体内抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白之间协同作用，共同决定细胞是否进入凋亡程序。在本实验中，与对照组比较，模型组细胞凋亡蛋白Caspase-3活性明显升高，西红花进行干预后，Caspase-3蛋白的表达明显减少，这些说明了CORT诱导的PC12细胞的凋亡可能与Caspase-3依赖的凋亡通路有关，西红花可抑制该凋亡蛋白的表达。综上表明西红花能够有效的保护CORT诱导的PC12细胞的损伤。但西红花抗抑郁的物质基础和更为确切的分子机制及信号通路并还尚未明确，其具体机制尚需进一步探究。

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