欧嘉勇 吴嘉玲 魏秋静 古洁若

【关键词】 强直性脊柱炎;代谢组学;外源性代谢物;环境因素;超高效液相色谱-质谱

Evaluation of environmental risk factors of ankylosing spondylitis based on metabolomics Ou Jiayong，

Wu Jialing， Wei Qiujing， Gu Jieruo. Department of Rheumatology， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding author， Gu Jieruo， E-mail： gujieruo@ 163. com

【Abstract】 Objective To identify the environmental risk factors of ankylosing spondylitis （AS） by comparing the serum exogenous metabolites between AS patients and healthy controls.  Methods Ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry （UPLC-MS） was applied to detect the serum metabolic profiles in 49 AS patients and 28 healthy controls. Random forest （RF） model combined with univariate statistical analysis were utilized to identify the differential metabolites between two groups. The characteristics of exogenous metabolites and their correlation with C reactive protein （CRP） and erythrocyte sedimentation rate （ESR） were studied.  Results Lowretention time deviation of each sample suggested that the detection process was stable. The overall prediction error rate was 0.143， indicating that the RF model was successfully established. After the combination with univariate statistical analysis， 10 exogenous metabolites with an adjusted error detection rate < 0.5 were obtained. The normalized peak intensities of any two of diethofencarb， Avenanthramidea and dibenzofuran were significantly correlated （all r > 0.95，all P < 0.01）. The normalized peak intensities of dibenzofuran， Avenanthramide a， BAXGP and diethofencarb were positively correlated with CRP and ESR （all P < 0.05）.  Conclusions Serum metabolomics can reflect the environmental risk factors of AS to certain extent. The exogenous metabolites might be associated with the severity of AS.

【Key words】 Ankylosing spondylitis;Metabolomics;Exogenous metabolite;Environmental factor;

Ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry

强直性脊柱炎（AS）是一种累及中轴关节为主，可伴有葡萄膜炎、起止点炎、银屑病、炎症性肠病等外周表现的自身炎症性疾病。AS病因尚不明确，目前认为与HLA-B27相关，并受环境影响[1]。代谢组学主要是研究生物体中某种体液在受到长期外源性刺激或基因修饰后机体内代谢物的变化[2]。目前有关AS的代谢组学特点在国内尚未见报道。为此，本研究采用超高效液相色谱-质谱（UPLC-MS）检测AS患者及健康志愿者（HC）的血清代谢组学差异，研究外源性差异代谢物的特点，探讨与AS相关的环境危险因素。

对象与方法

一、研究对象

选择2014年1月至2017年7月在我科就诊的49例AS患者为AS组。该49例均符合以下标准：①1984改良的AS纽约诊断标准;②年龄大于18岁;③未接受过TNF-α阻断剂治疗;④排除其他类型风湿病及全身代谢性疾病。其中男39例、女10例，年龄29（18，53）岁，病程

6.0（0.1，24.0）年，CRP（1.03±0.21）mg/L，ESR

（20.77±7.84）mm/h，Bath AS疾病活动度指数（BASDAI）3.0（0，6.9），HLA-B27阳性47例。另

选择年龄大于18岁、排除脊柱关节病或其他类型风湿病及全身代谢性疾病的28名HC为对照组。AS组与HC组的性别、年龄及BMI比较差异均无统计学意义（P均> 0.05）。本研究经中山大学附属第三医院医学伦理委员会批准，并征得所有受试者的知情同意。

二、方 法

1. 主要试剂及仪器

乙腈、甲醇及超纯水购自德国默克公司，甲酸购自上海CNW公司，2-氯苯丙氨酸购自GL 生化（上海）有限公司。液相色谱-质谱（LC-MS）分析采用赛默飞世尔科技Orbitrap EliteTM 组合型离子阱Orbitrap质谱仪及HypersilTM BDS C18 色谱柱（长100 mm，直径2.1mm，粒径1.9 μm）。

2. 樣品制备

于清晨采集受试者的外周血，分离血清，置于-80 ℃保存。使用前将血清样本置于室温解冻，取100 μl血清样本加入300 μl甲醇以沉淀血清中蛋白，并加入10 μl内标（2.9 mg/ml，2-氯苯丙氨

酸），涡旋混匀30 s，置于4 ℃离心机中，12 000 ×g离心15 min。吸取200 μl上清液，转入进样小瓶检测。

3. UPLC-MS检测

取制备好的样品进行UPLC-MS检测。首先进行流动相洗脱，色谱分离条件：柱温40 ℃，流速0.3 ml/min，流动相A为水、0.1%甲酸，流动相B为乙腈、0.1%甲酸。自动进样器温度4 ℃。质谱检测参数：正模式时的加热器温度300 ℃，鞘气流速45 arb，辅助气流速15 arb，尾气流速1 arb，电喷雾电压3.0 kV，毛细管温度350℃，S-棱镜射频分数为30%;负模式时的加热器温度300 ℃，鞘气流速45 arb，辅助气流速15 arb，尾气流速1 arb电喷雾电压3.2 KV，毛细管温度350℃，S-棱镜射频分数为60%。

三、统计学处理

使用XCMS R包绘制保留时间vs.保留时间变异程度曲线对读取前数据进行稳定性评价，利用Compoud Discoverer软件对LC-MS检测数据进行提取，整理成二维数据矩阵形式，包含保留时间、分子量、观察量（样本名称）、可提取物质个数和峰强度等信息;将原数始据进行峰强度归一化、标准化，根据质量控制样本计算每个特征峰的相对标准偏差（RSD），应用Metaboanalyst 4.0的随机森林分类算法，将AS组与HC组设为预测终点，决策树数目为500，将所有代谢物放入模型中，运行模型算法，对RSD < 30%并且能与数据库匹配的特征峰构建随机森林模型及进行单变量统计分析。差异物质筛选标准：按分类精度的贡献度对特征峰进行排序，贡献度大于0，并且单变量统计分析校正后错误发现率（FDR）< 0.5。FDR为根据数据类型进行组间参数检验（t检验）或非参数检验（秩和检验）后得到P值并进行校正后所得。2组间峰强度倍数变化（FC）=AS均数/HC均数。使用人类代谢组学数据库检索并确定代谢物来源。正态分布的计量资料以表示，非正态分布的计量资料以中位数（上、下四分位数）表示。采用Pearson相关分析差异代谢物与CRP和ESR以及差异代谢物标准化峰强度之间的相关性。所有统计分析采用SPSS 20.0和R 3.5.1。

结 果

一、代谢组学检测的质量评价

保留时间vs.保留时间变异程度曲线显示，每例样本在代谢物检测过程中系统波动，整体而言，各例样本保留时间曲线基本相似，未见变异特别大的曲线，即没有离群样本;单例样本的保留时间变异基本没有超过0.1，每例样本在检测过程当中也基本稳定，提示UPLC-MS检测系统是稳定、可靠的，见图1。

二、随机森林模型的建立及外源性差异物质的鉴定

决策树数目到150 ～ 200时，模型趋于稳定，见图2，AS与HC能明确地分成2组，总体预测错误率为0.143，处于较低水平，模型建立成功。根据特征峰的分类精度贡献度，结合单变量统计分析，得到模型中重要分类代谢物中的10个外源性代谢物，见表1，外源性代谢物来源多样，某些可能是潜在的毒性物质。各种差异外源性物质在AS组与HC组的数据分布散点图见图3。相关性分析显示，乙霉威、Avenanthramide a及二苯并呋喃三者的峰强度两两高度相关（r均> 0.95，P均< 0.01），见图4。

三、外源性代谢物与炎症指标的相关性分析

二苯并呋喃、Avenanthramide a、BAXGP、乙霉威的标准化峰强度与CRP及ESR均呈正相关（P均< 0.05），见表2。

讨 论

AS是一种与HLA-B27密切相关的自身炎症性疾病，但其发病不能完全从基因的角度进行解释[3-4]。研究表明，婴儿期的非母乳喂养方式及童年时因呼吸道感染住院等均可能增加成年后发展为AS的风险[5-6]。在疾病模型研究中发现，无菌的HLA-B27转基因小鼠不会发生AS关节炎的表现[7]。由此表明，环境因素可能作为一个触发因素参与到AS的发病或疾病进展当中。本研究尝试通过探讨AS患者与健康人群在血清代谢组学中的区别，从外源性差异代谢物的特点及来源分析AS患者潜在的环境危险因素。随机森林模型结果显示，AS患者的血清代谢组学轮廓与健康人群区分明显;差异代谢物中有10种为外源性代谢物，其来源不尽相同。

本研究中，AS患者血清中谷物类食物的标记物Avenanthramide a升高，并与CRP及ESR呈正相关。Cao等[8]的研究表明，长期的高糖型膳食结构可以引起肠黏膜ATP水平升高，引起炎症因子IL-17的表达增加;而且有趣的是，农药成分乙霉威、防腐剂对羟基苯甲酸丁酯及二苯并呋喃在患者血清中也升高，且谷类标记物Avenanthramide a与这些毒素具有较高的相关性，这说明潜在的毒性物质可能是随着长期的谷类物质的进食而进入患者体内。二苯并呋喃、乙霉威与CRP和ESR也呈正相关，可能是因为毒性物质在数据上与Avenanthramide a呈现共线性的结果。另有研究表明，肠道菌群参与到AS的发病及疾病进展AS患者往往伴发无临床症状的肠道炎症[9-10]。上述均表明，AS患者的肠道环境与健康人群存在区别，其肠黏膜对各类毒素及食物的吸收能力可能发生改变。

吸烟是AS疾病活动度的独立危险因素[11]。本研究中，烟草的2种代谢物2-氨基萘及金合欢醇丙酮在AS与健康人群之间存在差异，但并不与CRP或ESR相关，而且金合欢醇丙酮水平在AS患者体内下降，因此烟草代谢物对于AS患者的作用在本研究中并不明确，有待进一步探究。

多种茶叶来源的代谢物在AS患者血清中升高，BAXGP与ESR及CRP呈正相关。目前没有茶叶成份与AS发病相关的报道。喝茶是一种令人放松的习惯，而AS患者可因疾病活动时的炎性腰背痛导致睡眠障碍，也可能导致一些抑郁情绪[12]。喝茶的过程所带来的身心放松过程可能在一定程度上可以改善患者的情绪。今后我们将在流行病学进行相关的调查以验证这一猜想。

综上所述，本研究通过对代谢组学中外源性差异代谢物特点进行研究，得到一些与AS发病可能相关的环境危险因素，如高糖饮食、吸烟等，而这些代谢物也可能反映了患者独特的环境接触因素或生活习惯。

参 考 文 献

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（收稿日期：2019-01-31）

（本文編辑：林燕薇）