张名媛 郭晓萍 孙晴超 司景磊 兰干球 郭亚芬 蒋钦杨

摘要：【目的】构建广西巴马小型猪miR-148b慢病毒表达载体并对其靶基因进行预测及相关通路分析，为揭示miR-148b的作用机制打下基础。【方法】以广西巴马小型猪血液基因组DNA为模板，扩增miR-148b的前体及部分侧翼序列，使用T4连接酶将目的片段连接至pLV-CMV-MCS-EF1载体上，构建获得pLV-miR-148b慢病毒表达载体;以pLV-miR-148b慢病毒表达载体转染293T细胞48 h后进行表达验证;利用miRDB、miRWalk 2.0和TargetScan 7.2三大数据库预测分析广西巴马小型猪miR-148b的靶基因，并以MirPath v.3分析miR-148b靶基因相关通路。【结果】广西巴马小型猪miR-148b片段大小为385 bp，与miRBase 21.0网站上已发布猪miR-148b成熟序列（前体和侧翼序列）的同源性达100%。构建获得的pLV-miR-148b慢病毒表达载体能在293T细胞中成功表达，且相对表达量极显著高于pLV-GFP慢病毒空载质粒转染组（P<0.01）。数据库预测分析得到18个广西巴马小型猪miR-148b的靶基因，分别为CLOCK（时间昼夜调控因子）、MIER1（转录调控因子）、MECP2（甲基化CpG结合蛋白）、ZNF704（锌指蛋白）、SPTY2D1（SPT2染色质蛋白）、QKI（RNA结合蛋白）、ZBTB20（锌指蛋白）、MGAT4A（钠/磷酸转运蛋白）、UHMK1（编码蛋白激酶）、PIK3C2A（磷酸肌醇-3-激酶2α肽）、C6orf62（6号染色体开放阅读框62抗体）、HECW2（E3泛素蛋白连接酶）、MAP1B（微管相关蛋白）、NHS（NHS肌动蛋白调节因子）、B4GALT6（β-1，4-半乳糖基转移酶）、ATP2A2（肌浆ATP酶/内质网Ca2+转运酶）、AP4E1（蛋白复合物接头分子）和BBX（锌指蛋白）;且发现有11条靶基因相关通路，其中与疾病相关的通路有脂肪酸合成通路、细胞外基质受体相互作用通路、癌症的蛋白聚糖通路、神经胶质瘤通路、癌症的小分子核糖核酸通路、肾细胞癌通路、N-聚糖生物合成通路和致心律失常性右室心肌病通路。……