吴丽芳　魏晓梅

摘要：  该研究以蔗糖、麦芽糖、山梨醇及PEG（6000）为渗透剂，探讨了不同渗透剂对白刺花体细胞胚发育、胚成熟及萌发的影响。结果表明：白刺花下胚轴形成的胚性愈伤组织接种至MS + 2，4-D 0.2 mg·L-1 + NAA 1.0 mg·L-1 + 6-BA 2.0 mg·L-1 + TDZ 1.0 mg·L-1+蔗糖40 g·L-1+ 谷氨酰胺100 mg·L-1+植物凝胶3 g·L-1的培养基上，体细胞胚发生率高达66.21%，总胚数为79个;7%蔗糖可使体细胞胚成熟率高达64.36%，同時也可提高多子叶畸形胚形成;2%麦芽糖+2%山梨醇+4%蔗糖组合使体细胞胚成熟率最高达88.89%，畸形胚比例最低;30 g·L-1PEG培养时，体细胞成熟率最高，为82.35%;鱼雷期的体细胞胚最合适转接，可使体胚萌发率达90.58%，复合糖上培养得到的成熟体细胞胚生根率最高，为87.47%。这为实现白刺花体细胞胚育苗奠定了理论基础，并提供了可行的方案。

关键词： 白刺花， 渗透剂， 体细胞胚， 体细胞胚成熟， 体细胞胚萌发

中图分类号：  Q943.1文献标识码：  A文章编号：  1000-3142（2019）08-1107-08

Abstract：  To discuss the effect of different penetrants on maturation and germination of somatic embryo of Sophora davidii. Sucrose， maltose， sorbitol and PEG （6000） were used as penetrant in this paper. The development， maturation， and germination of somatic embryo was determined by different penetrant comparation. The results were as follows： the rate of somatic embryogenesis reached up to 66.21%， and the total number of embryos can achieve 79 when embryonic callus from hypocotyl of Sophora davidii were cultured in MS+ 2，4-D 0.2 mg·L-1 +NAA 1.0 mg·L-1+ 6-BA 2.0 mg·L-1 + TDZ 1.0 mg·L-1+sucrose 40 g·L-1+ glutamine 100 mg·L-1+plant gel 3 g·L-1. Adding 7% sucrose could promote the maturation rate of somatic embryo to 64.36%， meanwhile could also increase the development of polycotyledonous abnormal embryo. The maturation rate of somatic embryo went up as high as 88.89%， and the proportion of abnormal embryo the lowest， when somatic embryo were cultured in 2% maltose +2% sorbitol +4% sucrose combination medium. The maturation rate of somatic embryo was 82.35%， when the concentration of PEG was 30 g·L-1. Torpedo embryo was suitable for transported culture， the formative rate of somatic embryo was up to 90.58%. The rooting rate of mature somatic embryo was high， for 87.47% from three sugar combination culture. This study provides a theoretical reference and a feasible scheme for the development of somatic embryo seedling of Sophora davidii.

Key words： Sophora davidii，  penetrant， somatic embryo， somatic embryo maturation， somatic embryo germination

植物组织培养中体细胞胚发生途径是获得再生植株有效方法之一，由于体细胞胚发生具有数量多、来源于单个的原始胚性细胞、遗传相对稳定、结构完整、再生率高、可作为外源基因转化受体等优点（Gupta & Pullman，1991），已成为遗传改良和人工种子生产的原材料以及快速繁育和商品化生产种苗的前提（胡颂平和刘选明，2014）。最早通过体细胞胚发生的报道来自Steward（1958）和Reinert（1959）对胡萝卜根的培养，随后在一些草本植物中相继培养获得成功，木本植物由于生长发育规律、器官部位等与草本植物有较大差异，使木本植物体细胞胚胎发生的种类很有限，在世界范围内，目前通过体细胞胚发生途径诱导并培育出再生植株的木本植物180余种。国外对栎属（Quercus L.）、杨属（Populus L.）、挪威云杉（P. abies）、白云杉（P. glauca）、黑云杉（P. mariana）等研究较为深入全面，且花旗松（Pseudotsuga menziesii）、火炬松（Pinus taeda）、辐射松（P. radiata）、挪威云杉（Picea abies）、水曲柳（Fraxinus mandshurica）、杂交鹅掌楸（Liriodendron hybrids）等体细胞胚的诱导和再生植株已成功应用于生产实践中，并进行商业化的苗木生产。桉树（Eucalyptus camakdulensis）、北美鹅掌楸（Liriodendron tulipifera）、欧洲落叶松（Larix decidua）等利用其体细胞胚发生体系，实现了抗病虫、抗逆等基因转移（陈金慧等，2003）。然而，截至目前为止，白刺花（Sophora davidii）有关方面的研究尚属空白。

白刺花（Sophora davidii）為豆科槐属落叶灌木，在西南喀斯特地区和北方干旱地区常作水土保持的先锋树种（李芳兰等，2009;何晓，2007;何建利等，2018）。白刺花根、茎、叶、花、和种子均可入药，具有清热利咽、消热解暑和凉血消肿等功效（毛晓健等，2009）。小花数多、密集，是春天优良的蜜源植物和天然无公害“绿色食品”（樊建，2005）。在白刺花的开发利用中调查发现，白刺花虽然开花数多，结实量大，但由于种子硬实（吴丽芳等，2014）、种皮透水透气性差且具有休眠性（吴丽芳等，2018），所以自然状态下幼苗少、种群更新慢，从而限制了幼苗的生长及定居。若能通过体细胞胚发生途径形成再生植株，这无疑是解决有性繁殖种苗慢的有效途径之一。然而，通过前期对白刺花的研究发现，体细胞胚诱导中存在诱导率低、萌发率低等问题。因此，本研究在前期研究基础上，以优化白刺花体细胞胚培养条件，提高体胚的成熟和萌发，探索影响体胚分化中生长素和细胞分裂素浓度配比，筛选适宜的培养条件，针对体胚萌发率低的问题，通过调节培养基中的渗透压和培养基内的组成成分来确定萌发过程中所需要的营养物质和关键因素，以期为实现白刺花体细胞胚育苗奠定理论基础和提供可行的方案。

1.5 白刺花生根培养与植株再生

不同渗透剂培养得到的成熟体细胞胚转入生根培养基进一步培养，生根培养为1/2MS+ NAA0.2 mg·L1+2 g·L1活性炭+蔗糖30 g·L1+琼脂7 g·L1，直至获得完整植株，最后将幼苗炼苗后移栽至装有基质（腐殖土∶珍珠岩= 2∶1）的花盆中，30 d后统计植株成活率。

植株成活率=移栽成活的植株（株）/移栽的总株数（株）×100%。

2 结果与分析

2.1 白刺花体细胞胚的诱导

胚性愈伤组织接种至MS + 2，4D 0.2 mg·L1 +NAA 1.0 mg·L1+6BA 2.0 mg·L1+TDZ 1.0 mg·L1+蔗糖40 g·L1+谷氨酰胺100 mg·L1+植物凝胶3 g·L1的培养基后，前10 d内可见胚性愈伤组生长，表面松软，稍颗粒状（图1：A）。随着培养时间的增长，愈伤表面淡黄色，光滑突起，30 d左右突起圆柱状纵向伸长（图1：B），有幼小的体胚开始发育而成（图1：C）。培养40 d后，可以得到高频发生的白刺花体细胞胚，包括球形胚、心形胚、鱼雷形和少部分子叶胚。经统计，体细胞胚发生率为66.21%，每克愈伤组织上获得的总胚数为79个，其中球形胚52个，心形胚18个，鱼雷胚8个，子叶胚4个。形成的子叶胚中，一个仅有1片子叶，1个有多个子叶，另外两个形态正常。

2.2 渗透剂对白刺花体细胞胚成熟的影响

2.2.1 蔗糖对白刺花体细胞胚成熟的影响 蔗糖在植物离体培养时既可以提供能源，又能起到调节渗透压的作用，以4%的蔗糖为研究对照。从表1可以看出，随着蔗糖浓度的增加，体细胞胚趋于成熟，蔗糖浓度为7%时，体细胞胚成熟率最高，达64.36%;蔗糖浓度为2%时，体细胞胚成熟率最低，仅35.58%。从研究中观察到，低浓度的蔗糖和高浓度的蔗糖都不利于正常体细胞胚的发育。低浓度时，体细胞胚长势差，出现透明水渍状的玻璃胚，生活力弱，逐渐变褐死亡;高浓度蔗糖时，多子叶畸形胚形成，且有簇生的类似单子叶胚拥有共同胚轴的体胚，此类体细胞胚不能进一步发育。相对适合的蔗糖浓度为5%～6%，体胚粗壮膨大，下胚轴伸长。

2.2.2 复合糖对白刺花体细胞胚成熟的影响 麦芽糖、蔗糖和山梨醇不同组合对白刺花体细胞胚成熟的影响结果见表2。从表2可以看出，在不同浓度的麦芽糖与蔗糖组合中， 体细胞胚成熟率随着麦芽糖浓度的增加而上升。当麦芽糖浓度为7%时，体细胞胚成熟率最高，达86.27%，相应的畸形胚发生率也最高，为22.73%;麦芽糖浓度为2%时，体胚成熟率为57.41%，畸形胚占总成熟胚的比例为22.58%;麦芽糖浓度为5%时，畸形胚比例最低，仅为10.81%。在山梨醇与蔗糖的组合中，成熟体细胞胚胎数也是随着山梨醇浓度的增加而增加。2%的山梨醇与蔗糖组合时，体细胞胚成熟率最低，仅51.79%;7%的蔗糖时，体细胞胚成熟率最高，为78.18%，畸形胚比例为18.60%;山梨醇为中等浓度5%时，体细胞胚成熟率为71.93%，畸形体胚率最低， 为9.76%。在2%麦芽糖与2%山梨醇和4%蔗糖组合中，得到的体细胞胚成熟率最高，为88.89%，畸形胚比例最低，仅6.25%。这说明糖源的种类及浓度对体细胞胚成熟率和畸形胚的比例有影响作用。

2.3 PEG对白刺花体细胞胚成熟的影响

PEG作为渗透剂通常能引起水分胁迫， 使细胞内蛋白质的合成受抑，细胞分别受阻，加速体细胞胚的发育。表3为不同浓度PEG对白刺花体细胞胚成熟的研究结果。由表3可知，PEG浓度为30 g·L1时，体细胞成熟率最高，达82.35%，畸形胚比例仅为9.52%;而PEG浓度超过30 g·L1，体细胞胚成熟率则开始下降，当PEG浓度为70 g·L1时，体细胞胚成熟率仅为41.51%，而畸形胚比例却高达31.82%。

2.4 白刺花体细胞胚的萌发

过渡期得到的不同发育期的体细胞胚接种于不含任何激素的体胚萌发培养基上，其体细胞胚萌发能力不一致，球形胚接种后需先经心形期，鱼雷期和子叶期，再形成子叶胚直至发育出幼苗，40 d左右，成苗时间长，形成的幼苗长势稍弱。心形胚培养时，其发育仍先发育成鱼雷胚再经历子叶胚;子叶胚培养时，部分体胚颜色会先变成米白色呈衰老状态最终褐化而死;而鱼雷胚转接时，10 d后则转变为子叶胚，子叶逐渐展开，随后颜色变为绿色，胚轴伸长，基部主根开始生长，20 d左右，可见小幼苗长成，成苗时间快，畸形苗少，形成的幼苗长势健壮。不同的体细胞胚其萌发能力见表4，鱼雷期的体胚萌发能力最高，为90.58%，成苗质量为每棵103 mg，而球形期的体胚萌发率则最低，仅69.77%，成苗质量为每棵81 mg。

2.5 白刺花生根培养与植株再生

不同渗透剂培养得到的成熟体细胞胚转入生根培养基中培养（图2： A），麦芽糖+山梨醇+蔗糖组合培养基的成熟体细胞胚生根率最高，为87.47%，除主根长出外，有些小苗还有5～6根侧根，且下胚轴健壮、根粗壮、子叶舒展（图2： B）;仅蔗糖的培养基上，生根率（为77.51%）不如复合糖上的培养;而在PEG的培养基上培养的体细胞胚，生根率则介于两者之间，为82.13%。将得到的幼苗（图2： C）在培养室打开瓶塞炼苗7 d后，移栽至温室花盆中，前20 d内保持湿度在80%以上，避免强烈阳光直射，30 d后幼苗移栽成活率在92%以上。

3 讨论

植物组织培养中添加的糖类有蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖、甘露醇、山梨醇等。糖类除为细胞提供C、H、O、N等必要元素外，还起到调节渗透压的作用。蔗糖是植物培养时经常使用的糖类，一般使用浓度为2%～5%，特殊培养如花药或幼胚培养需较高的蔗糖浓度，从而对体细胞胚的发育起到重要作用。细胞培养和原生质体培养时，为了使培养物生长良好，除蔗糖外，还需配合其它糖類。许建秀等（2017）在抗松材线虫病赤松体细胞胚的发育和成熟萌发研究中使用麦芽糖与蔗糖对比，得出60 g·L1麦芽糖比蔗糖更适宜抗病赤松的体细胞胚发育和成熟。齐力旺等（2004）对华北落叶松的研究表明，3%麦芽糖与4%的PEG（4000）的组合比蔗糖与PEG（4000）组合效果好，且体细胞胚成熟频率高，植株生根率达57.89%，体细胞胚质量优于蔗糖和PEG4000组合。顾晓川等（2018）对橡胶的研究中发现，蔗糖添加量不影响胚状体的再生率，蔗糖添加量对橡胶树胚状体植株再生的株高和抽叶影响较大。本研究不同糖类及糖类组合均影响体细胞胚的成熟。单一使用蔗糖浓度为5%～6%，形成的体细胞胚粗壮膨大，下胚轴伸长。过高的蔗糖浓度，虽可提高白刺花体细胞胚成熟率，但会增加畸形胚的比例。

PEG作为渗透调节剂促进体细胞胚成熟早有报道，其原理是引起细胞失水，使细胞内含物的浓度相应提高，促进体胚的成熟及萌发。孙桂君（2009）对水曲柳体细胞胚成熟及萌发的研究中发现，添加70 g·L1的PEG对水曲柳的体胚成熟有明显的促进作用，研究认为适度的PEG可促进体细胞胚的成熟，但过高浓度的PEG反而会使体细胞胚成熟率降低和增加畸形胚比例。分析其原因可能是适当PEG透压引起水分胁迫，能够使细胞内正常的蛋白质合成受阻，而相应地诱导一些胁迫蛋白质合成，达到调节代谢，则抑制愈伤组织细胞的分裂，加速胚的发育，使体细胞胚胎早熟并抑制成熟胚的萌发（高述民，2001）。

白刺花下胚轴经过胚性愈伤组织诱导，在MS+2，4D 0.2 mg·L1 +NAA 1.0 mg·L1+6BA 2.0 mg·L1+TDZ 1.0 mg·L1+蔗糖4%+谷氨酰胺100 mg·L1+植物凝胶0.3%的培养基上诱导体细胞发生，可使体细胞胚发生率达66.21%;蔗糖浓度会影响体细胞胚的成熟和增加畸形胚的比例。2%麦芽糖+2%山梨醇+4%蔗糖培养时，体细胞胚成熟率高达88.89%， 30 g·L1PEG可使体细胞胚成熟率达82.35%，鱼雷期体细胞胚转接最合适，幼苗炼苗后，移栽成活率达92%。本研究结果可为实现白刺花体细胞胚育苗奠定理论基础和提供可行的方案。

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