刘晓丽 魏楠

摘要：通过构建重组表达载体，转化农杆菌制作浸染液，实现农杆菌介导法进行目的基因的拟南芥遗传转化，将目的基因转入到野生型拟南芥中。通过筛选和鉴定后，得到阳性的转基因植株，最终得到纯合T3代转基因株系。后续可以通过对纯合转基因株系和野生型拟南芥进行比较鉴定，即可推断目的基因在拟南芥中的功能。

关键词：拟南芥;遗传转化;实验

一、实验材料

（一）试验材料

转基因所需的菌株：农杆菌EHA105;转基因所需的模式植物：野生型拟南芥;转基因所需的植物表达载体：pCAMBIA3301。

（二）试验试剂

本实验所需试剂主要有：Mu-rashige Skoog（MS）培养基：M519（Phyto Technology Laboratories，LLC）;YEB、YEP液体培养基;YEP固体培养基;抗生素氯霉素（chlorampheni-col，Chl）、卡那霉素（kanamycin，Kan）;草铵膦（phosphinothricin，PPT）;v/v（1：5）的次氯酸钠溶液;琼脂;蔗糖;表面活性剂silwetL-77等。

二、实验方法

（一）超表达载体的构建

采用质粒小提试剂盒提取扩增、测序结果均正确无误的pGM-T-目的基因的质粒，具体步骤如下：第一，取2ml过夜培养的含目的基因的大肠杆菌Trans 5a转化菌液，12，000rpm离心I min，吸除上清;第二，向留有菌体沉淀的离心管中加入150ul溶液P1（已加入RNase A和0.5%的TIANRed），使用涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀;第三，向离心管中加入150ul溶液P2，温和地上下翻转6～8次，使菌体充分裂解;第四，向离心管中加入350ul溶液P5，立即快速地上下颠倒12-20次，充分混匀，将出现絮状沉淀，然后，12，000rpm离心2min;第五，将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中，注意尽量不要吸出沉淀。12，000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液;第六，向吸附柱CP3中加入3001xl漂洗液PWT，12，000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液;第七，重复步骤六;第八，将吸附柱CP3放入收集管中，12，000rpm离心1rain，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除;第九，将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50ul洗脱缓冲液TB，12，000rpm离心30s将质粒溶液收集到离心管中。进行质粒提取后，用两个内切酶BglII和Pmll分别对pGM-T一目的基因的质粒和pCAMBIA3301载体进行双酶切。加样结束后，混匀，37℃酶切10h。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，且对目标片段及pCAMBIA3301骨架进行胶回收。然后，通过连接酶对目标片段和pCAMBIA3301骨架进行连接，构建重组表达载体。转化大肠杆菌Trans 5a感受态，挑斑、摇菌，进行菌液PCR检测。挑取阳性pCAMBIA3301一目的基因克隆提取质粒，进行双酶切验证和测序。测序正确后，阳性pCAM-BIA3301-目的基因克隆質粒转化农杆菌EHAl05感受态。

（二）转化野生型拟南芥

1、野生型拟南芥的种植。野生型拟南芥的种植发苗有直播法和组培法。本实验中采用组培法。将野生型拟南芥种子播种于MS固体培养基（不含抗生素）上，待长出四叶一心后移栽至花盆中，具体方法如下：第一，MS培养基准备：M519粉末、蔗糖溶于去离子水中，终浓度分别为4.43g/L、30g/L，pH调节至5.8左右，后加入琼脂（终浓度为7g/L），于121°C，高压灭菌25min。待MS固体培养基冷却到不烫手的程度后，无菌条件下，将其分装到培养皿内，凝固待用。第二，种子消毒：（1）拟南芥种子（200～300粒）置于1.5mL的离心管内;（2）加入I mL75%乙醇溶液消毒I min;（3）吸出乙醇溶液，加入I mL的次氯酸钠溶液（Naclo：ddH2O=l：5），振荡洗涤8～10min，短暂离心;（4）在无菌条件下倒掉消毒液，后用无菌去离子水冲洗5-6次。第三，播种：移液枪吸取已消毒的种子于无菌滤纸条上，使用无菌牙签点播至MS固体培养基上。株距1cm，行距1cm，播种完毕后，封口膜密封，4℃黑暗放置72h。第四，培养：平板至于培养室内，光周期为23℃光照16h，20℃黑暗8h培养7-10d。待植株长至四叶一心时，移栽至营养土里。第五，移栽：营养土使用前需121°C，灭菌30min。冷却后，营养土、蛭石按l：1的比例混匀，除去杂质后装进小花盆放置于托盘内，向托盘内喷洒去离子水至表土湿润为止。

2、浸染。浸染液的准备，方法如下：（1）取检测结果为阳性的保存于-80°C的农杆菌菌液500uL于20mL含Chl（50mg/L）和Kan（50mg/L）的YEP液体培养基中活化培养;（2）28°C，220rpm，培养至培养基浑浊为止;（3）取以上菌液1mL于200mL含Chl和Kan的YEB液体培养基中进行继代培养;（4）28℃，220rpm，培养至菌液OD600值为1.0-1.2，不得超过1.2;（5）上述菌液置于4℃，5000rpm条件下离心10min，收集菌体;（6）使用转化缓冲液重悬菌体，至使OD600为0.8左右，若OD值过高会影响拟南芥后期长势，若OD值过低则会影响转化效率;（7）菌液重悬后加入表面活性剂silwet L-77（每10mL菌液加入2uL silwet L-77），混匀静置一段时间。采用浸染花序法浸染野生型拟南芥植株，方法如下：（1）当野生型拟南芥植株抽薹3-8cm，即可进行浸染;（2）选择其中生长健壮、长势相似的野生型拟南芥植株进行浸染;（3）浸染前要对植株进行初步的处理：剪去花葶上已经开放的花朵和已经形成的荚果，仅保留刚露白的花骨朵和花蕾;（4）提前向放置浸染植株的盒子内铺上一层滤纸，用喷壶打湿待用;（5）将刚露白的花骨朵和花蕾浸在浸染液中，定时5min;（6）植株上所有的花骨朵和花蕾浸染完全后，将植株倾斜放置于预先准备的盒子内，将盒子放置于20-25℃的环境中，暗培养;（7）22～24h后取出暗培养的植株，转至正常培养条件下继续培养;（8）为保证转化效率，拟南芥培养一周左右，进行第二次浸染。基于拟南芥的长势，在其整个生长周期内根据需要可浸染2～3次;（9）转化后两周左右，拟南芥结出大量荚果，使荚果自然成熟、干燥后，收取拟南芥种子即To代转基因种子;To代种子置于干燥的环境下2周以上即可用于后期的筛选。

3、纯合阳性转基因拟南芥株系的筛选。直播法是将To代种子均匀撒入花盆营养土中，表面覆盖一层薄土;保持营养土的湿润;当To代种子发芽长至3～4片真叶时喷洒50mg/L的PPT溶液;每天观察幼苗生长情况，3-4h后根据实际情况继续喷洒100mg/L或200mg/L的PPT溶液;最终存活的幼苗即为疑似阳性植株，取叶片进行分子鉴定。收获T1代种子进行后续实验。

4、阳性转基因株系的鉴定。鉴定为阳性的转基因To代植株，分株收获得到T1代转基因种子。组培法种植T1代转基因种子，由孟德尔遗传定律知T1种子的分离比，抗性植株：不抗植株=3：1，选择抗性植株中叶片和根系均生长正常的幼苗移栽，分株收获得到T2代种子;组培法种植T2代转基因种子，其中，几乎全部发芽的株系则为纯合株系，留下此株系的T3代种子。

三、结果与分析

（一）目的基因转化拟南芥

采用组织培养法进行野生型拟南芥的种植。待植株长至四叶一心之后，挑选长势一致的幼苗进行移栽。待野生型植株抽薹3-8cm且刚刚开始开花时即可进行浸染。待到荚果自然成熟、干燥后便收取得到To代种子。

（二）目的基因的阳性转基因苗的筛选

1、To代的筛选。由于pCAM-BIA3301载体上含有Kan和PPT抗性位点，所以，采用了直播法和组培法进行To代种子的种植。直播法是使用适当浓度的PPT喷洒植株幼苗进行筛选。组培法是将To代种子种植于含有Kan的MS固体培养基上进行筛选。阳性的转基因植株可以在喷洒PPT后正常生长，也可在含有Kan的MS固体培养基上正常生长。组培法中，由于抗生素Kan影响叶绿体、线粒体蛋白的合成，固不含有抗性基因的植株在MS培养基上萌发后黄化而死亡。直播法得到的疑似阳性植株和组培法中培养基上疑似阳性植株生长到一定阶段后将其移栽至新的營养土中继续培养。得到的疑似阳性转基因T。代植株，分株收获，得到T1代种子。

2、To代的筛选。将T。代种子点播至含有Kan的MS固体培养基上，由孟德尔遗传定律知T1代种子将按照3：1的比例发生分离，即有三分之一的T1代种子不能发芽。植株生长到一定阶段后选择移栽那些叶片嫩绿，根系发达的T1代幼苗。待荚果成熟后，分株收获，得T2代种子。

3、T2代的筛选。T2代种子的筛选同上，由孟德尔遗传定律知T2代种子一些株系按照3：1的分离比分离，而一些株系不发生分离即为纯合株系。将筛选出的纯和株系继续培养，得到T3代种子进行下一步的表型鉴定。

四、讨论

在拟南芥的生长周期内，温度要保持在20～25℃。在苗期时室内的湿度可适当高些，在生长周期内不超过50%。在拟南芥结荚时一般空气湿度应保持在30%左右。浸染期间，温度保持在20～25°C，避免温度太高。暗处理时间也不宜过长，一般22～24h即可，以免植株长时间避光而黄化，影响植株长势，从而降低浸染效率。

超量表达载体pCAMIBA3301所用启动子为35S启动子，可使目的基因超强表达，一般情况下，阳性转基因植株中的目的基因表达量会远远高于对照组植株，但由于转化、生长及外源基因整合位置的不确定性等多种因素，不同转基因植株目的基因的表达量会存在一定程度上的差异。因此，在研究过程中，为避免各株系之间的差异对功能研究的影响，选取目的基因表达量相近，且表达量较高的转基因阳性植株进行研究。基于植株自身的排外机制及遗传分离规律，将To及T1代定为不稳定世代，以T2或T3代作为纯合世代进行生理生化及分子功能研究，结果可信度更高，且表型或生理生化特征更加稳定。值得说明的是，单独使用抗生素（Kan）对转基因To代植株进行筛选时，会出现假阳性现象，从而加大后期T1代株系筛选的工作量，延缓了实验进程。因此，适时对To代转基因植株进行分子水平的鉴定，杜绝假阳性转基因植株的出现是非常有必要的。