萨如拉　春花　刘鑫岩　谭颖慧　尹利国　宫川剛　棚桥光彦

摘要：以羊毛为原料，采用熔融尿素法溶解羊毛分析其溶解机制.分别使用谷氨酸、胱氨酸、精氨酸、丝氨酸、亮氨酸、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、甘氨酰亮氨酸、甘氨酰甘氨酰甘氨酸等标准化合物替代羊毛角蛋白中主要的氨基酸、肽键及化学键，与150℃熔融尿素反应20min，经乙酸乙酯分液3次，有机层脱水浓缩，丙酮溶解，GC-MS分析，检测其反应产物及化学键的变化.结果表明：在使用不同标准化合物与熔融尿素反应中发现，仅胱氨酸、亮氨酸和甘氨酰-L-亮氨酸与尿素发生化学反应，部分二硫键及肽键发生断裂，其余标准化合物与尿素未发生化学反應.综上可知，在溶解条件为150℃ 20min时，尿素仅切断羊毛角蛋白中少量二硫键或肽键，使得羊毛角蛋白仍保持较高的分子量.

关键词：熔融尿素法;羊毛;溶解机制;角蛋白

中图分类号：TS102.311  文献标识码：A  文章编号：1673-260X（2019）09-0030-03

羊毛作为一种天然蛋白质资源，在国际上被认为是一种具有潜在价值的蛋白质，其蛋白含量高达99%[1].羊毛产业的废弃物、旧衣料品等每年大量产生[2]，仅其中一部分被重复利用，大部分废弃物被焚烧处理或填埋处理，这不仅污染了环境，更主要的是浪费了大量的蛋白质资源[3].因此，为了减轻环境负担，发展可持续性开发利用，研究羊毛角蛋白的提取方法和应用价值是目前亟待解决的问题.羊毛角蛋白的提取溶解是其再利用的至关重要的步骤，它对羊毛角蛋白的性能及其应用具有显著的影响[4].然而，大分子羊毛角蛋白内的二硫键使肽链内部和肽链之间发生交联，形成立体网状结构，使之难以溶解[5]，这给羊毛角蛋白的提取造成极大地困难.目前羊毛角蛋白的提取方法主要有酸碱法[6]、还原法[7]、酶法[8]、离子液体法[9]等，这些方法不仅需要大量的化学试剂造成环境污染，而且成本高、周期长、效率低.因此，开发新型的羊毛角蛋白提取技术是行之有效的方法之一，为实现高效、经济、环保的目标奠定基础[10].

棚桥光彦等开发了新型的羊毛角蛋白的提取方法-熔融尿素溶解法[11].本方法只使用尿素和乙醇，而尿素的熔融温度低，安全可靠，成本低，适合于大量生产，且尿素与乙醇可以回收循环利用.另外需要的时间短，尿素和羊毛角蛋白的分离过程简便，分离的蛋白质可以直接当作有机肥料或饲料等产品.经过实验已经确认羊毛在熔融尿素中可完全溶解，但具体的溶解机制尚不明确.因此，本文使用标准化合物替代角蛋白中的主要氨基酸、肽键及化学键与熔融尿素进行化学反应，使用GC-MS分析反应产物及二硫键及肽键的断裂状况，旨在探究熔融尿素法提取羊毛角蛋白的溶解机制.

1 实验材料和方法

1.1 材料、试剂及仪器设备

材料：羊毛日本毛绒株式会社.

试剂：尿素、乙酸乙酯、氯化钠、硫酸钠、丙酮，化学试剂均为分析纯.

标准化合物：谷氨酸、胱氨酸、精氨酸、丝氨酸、亮氨酸、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、甘氨酰亮氨酸和甘氨酰甘氨酰甘氨酸.

仪器设备：高温油浴锅、日本岛津气相色谱质谱联用仪（GC-MS）-QP5050A.

1.2 实验方法

1.2.1 标准化合物的选择

为了分析熔融尿素溶解羊毛的反应机理，分别选用谷氨酸、胱氨酸、精氨酸、丝氨酸、亮氨酸、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、甘氨酰亮氨酸、甘氨酰甘氨酰甘氨酸等标准化合物来替代羊毛角蛋白中的主要氨基酸、肽键及化学键与尿素进行化学反应.

1.2.2 尿素与标准化合物的化学反应

于干燥试管中加入2g尿素，在150℃油浴锅中加热至尿素熔融，再加入0.2g标准化合物，150℃反应20min，取出试管加入8mL的蒸馏水，冷却至室温，加入乙酸乙酯10mL，进行3次分液.有机层由20mL的食盐水脱水一次，再使用硫酸钠脱水，过滤除去硫酸钠，浓缩，加入丙酮（c=g/L）溶解，进行GC-MS分析.

GC-MS分析条件如下：进样温度230℃，气化室温度300℃，初始温度为100℃，保持5min，以10℃/min速率上升至300℃，保持5min，分析时间为30min[12].

测定仪器为GCMS-QP5050A;电离模式：EI（电子电离）;电压：70eV;毛细管柱：DB-5MS（J&W Scientific）、0.25mm（I.D.）×30m（L）×0.5μm;载气：He;测定方法：扫描.

2 结果与分析

2.1 尿素与胱氨酸反应

尿素与胱氨酸反应产物的有机层GC-MS色谱分析结果及峰对应化合物的结构如图1.胱氨酸与尿素反应后保留时间11min到15min之间出现了3种与环化尿素结合的胱氨酸化合物.3种化合物的区别在于是否含有二硫键，11min时出现的化合物的二硫键已经断裂，15min时出现的化合物仍然含有二硫键.本实验中尿素与胱氨酸反应产物的有机层回收量比较少，不能确定上述产生3中化合物的反应途径为主要的反应途径，但可以得到尿素切断二硫键的结果.

2.2 尿素与亮氨酸反应

尿素与亮氨酸反应产物的有机层GC-MS色谱分析结果及峰对应化合物的结构如图2.亮氨酸与尿素的反应也与胱氨酸反应一样，在保留时间15min的时候出现与环化尿素结合的亮氨酸化合物的峰.

2.3 尿素与甘氨酰-L-亮氨酸反应

甘氨酰-L-亮氨酸与尿素反应产物的有机层GC-MS色谱分析结果及峰对应化合物的结构如图3.在保留时间15min时候出现了与环化尿素结合的亮氨酸化合物峰，本实验也与胱氨酸反应同样，甘氨酰-L-亮氨酸与尿素反应产物有机层的回收量比较少，有可能尿素与甘氨酰-L-亮氨酸反应积极性不是很大，但与环化尿素结合的不是二肽而是氨基酸，可以得出尿素切断肽键的结果.

2.4 尿素与其他氨基酸及肽的反应

尿素与谷氨酸、精氨酸、丝氨酸、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、甘氨酰甘氨酰甘氨酸的反应产物的有机层中未发现尿素的反应产物.尿素与谷氨酸、精氨酸、丝氨酸、甘氨酸有可能不产生化学反应，不切断甘氨酰甘氨酸、甘氨酰甘氨酰甘氨酸的肽键.

3 结论与讨论

本文研究了羊毛在熔融尿素中的溶解机制.在使用标准化合物与熔融尿素的反应中，仅亮氨酸、胱氨酸、甘氨酰-L-亮氨酸与尿素发生化学反应，部分二硫键及肽键发生断裂，其余标准化合物谷氨酸、精氨酸、丝氨酸、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、甘氨酰甘氨酰甘氨酸与尿素未发生化学反应.可知，在溶解条件为150℃ 20min时，尿素仅切断羊毛角蛋白中少量二硫键或肽键，使得羊毛角蛋白仍保持较高的分子量.这与Murate[14]等的十二烷基苯磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定溶解羊毛角蛋白分子量的实验结果一致.为了更详细了解羊毛在熔融尿素中的溶解机制，分析20种氨基酸与尿素的反应是下一步需要研究的课题.

随着纤维产业的废弃物、破旧的衣料等蛋白纤维日益增加，如何利用废物纤维蛋白质已成为一个重要的课题，熔融尿素法可以从废弃的蛋白质纤维中大量提取蛋白质，为纤维蛋白的有效利用（比如加工成蛋白质饲料或有机氮肥料等产品）提供了参考.

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参考文献：

〔1〕Wang J B， Liu J Y， Wang J， et al. The Efficient Wool Keratin Dssolution Based on New Reductant [J].Advanced Materials Research， 2012， 441： 656-660.

〔2〕房启海，朱平，董朝红等.熔融尿素法提取羊毛角蛋白工艺研究[J].青岛大学学报，2016，31（2）：71-75.

〔3〕Zhao W， Yang R J， Zhang Y Q， et al. Sustainable and Practical Utilization of Feather Keratin by an Innovative Physicochemical Pretreatment： High Density Steam Flash-Explosion[J].Green Chemistry ，2012，14（12）：3352-3360.

〔4〕贾济如，姚金波.废弃羊毛角蛋白循环利用研究的最新进展[J].毛纺科技，2015，43（1）：45-49.

〔5〕李鵬飞，洪颖，陈双春，等.角蛋白的提取及其生物医学应用[J].高分子通报，2013（6）：7-11.

〔6〕Toran-Diaz I， Jain V K， Allais J J， et al. Effect of Acid or Enzymatic Hydrolysis on Ethanol Production by Zymomonas Mobilis Growing on Jerusalem Artichoke Juice [J]. Biotechnology Letters， 1985，7（7）：527-530.

〔7〕徐恒星，史吉华，周奥佳，等.羊毛角蛋白的提取及其成膜性[J].纺织学报，2010，33（6）：41-47.

〔8〕Eslahi N， Dadashian F， Nejad N H. Optimization of Enzymatic Hydrolysis of Wool Fiber for Nanoparticles Production Using Response Surface Methodology [J]. Advanced Powder Technology， 2013， 24（24）：416-426.

〔9〕Li R， Wang D. Preparation of Regenerated Wool Keratin Films from Wool Keratin-Ionic Liquid Solution [J]. Journal of Applied Polymer Science， 2013， 127（4）：2648-2653.

〔10〕王丽静，史吉华，周奥佳，等.新型羊毛角蛋白提取技术探究[J].毛纺科技，2013，41（5）：1-6.

〔11〕Tanahashi M， Murate H. Method of Classifying Proteins， Method of Dissolving Proteins， Method of Fractionating and Collecting Nonanimal Fiber and Proteins Originating in Animal Fiber： WOPatent，119596 A1[P]，2009.

〔12〕萨如拉，陈建兴，春花等.高压水蒸气蒸馏法提取和厚朴树枝有效精油成分[J].河南农业科学，2017，46（5）：152-156.

〔13〕山内清.ケラチンの化学と利用-現在の課題[J].高分子，2001，50（4）：241-243.

〔14〕Murate H， Shigematsu M， Abe K， et al. Molten urea as a novel dissolving solvent for wool and other animal proteins[J].Fiber，2010，66（6）：156-159.