谢兵兵，刘丽娟，卢宝全，韩富红，蔡梅芝，王丹丹，刘志辉，张艳红

(唐山市工人医院，河北唐山 063000)

赤芍为芍药科植物，主要活性成分为赤芍总苷，赤芍总苷具有多种生物活性，尤其对神经系统具有一定的药理作用，可以镇痛、改善神经突触可塑性损伤等。大量研究显示赤芍总苷对脑缺血损伤有明显的保护作用，且赤芍总苷的神经保护作用也已在神经病理学的动物模型中得到证实[1-2]，但有关其作用机制的研究较少。Notch信号通路在进化过程中是高度保守的信号转导通路，参与神经前体细胞自我更新能力的维持、增殖、分化与凋亡过程，局灶性脑梗死大鼠脑组织的Notch信号通路处于活化状态，该通路的活化程度与脑梗死的预后紧密相关[3-4]。文献报道赤芍总苷能够通过下调Notch信号通路从而抑制乳腺癌细胞的增殖和侵袭[5]，而赤芍总苷对局灶性脑梗死大鼠脑组织Notch信号通路是否存在干预作用进而治疗大鼠的局灶性脑梗死，目前尚鲜有报道，本课题就此进行了研究，现将结果汇报如下。

1 对象与方法

1.1 受试动物SPF级SD大鼠，体质量(180±20)g，雄性，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供[动物许可证号：SCXK(京)2016-0011]。大鼠适应性喂养7 d后进行试验。

1.2 主要试剂与仪器小鼠抗大鼠NICD、兔抗Hes1、兔抗Hes5和β-actin均购自美国Chemicon公司；免疫组化试剂盒购自武汉博士德公司；Trizol总RNA提取试剂(武汉天源生物技术有限公司)；SpectraMax i3x 多功能酶标仪(美国Molecular Devices公司)；石蜡切片机(德国Leica公司)；冰冻切片机(德国Leica公司)；BX53型光学显微镜(日本Olympus公司)；手术器械；动物手术台；天平。

1.3 方法

1.3.1脑卒中大鼠模型的制备 戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射全麻大鼠，大鼠全麻后置于操作台，分离右侧颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉。结扎颈外动脉及右侧颈总动脉近心端。在右侧颈总动脉近分叉处插入备用鱼线，将栓线送至大脑中动脉分叉处，颈外动脉与颈内动脉分叉处为起点，进线约18.5 mm，栓线尾端留于皮肤外，栓塞1.5 h后抽线实现再灌注。以动物清醒后爬行时右转圈，提尾时右前肢内收屈曲为入选标准。假手术组操作同上，仅暴露各组血管，不进行线栓插入。术后5 h采用Berderson评分评价存活大鼠的行为表现，评分2～4分提示造模成功。

1.3.2分组和给药 将“1.3.1”项下造模成功的脑卒中大鼠分为5组，分别为模型组、赤芍总苷低剂量组、赤芍总苷中剂量组、赤芍总苷高剂量组和尼莫地平组，选择假手术组大鼠为对照组，每组20只。对照组和模型组给予蒸馏水，赤芍总苷各剂量组分别给予灌胃赤芍总苷(由我院制剂科提供)5、10和20 mg/kg，尼莫地平组灌胃尼莫地平2 g/kg(亚宝药业集团股份有限公司，国药准字：H14022821，规格20 mg/片)，连续给药20 d。

1.3.3体质量测定 记录各组大鼠给药后的体质量变化，进行组间比较。

1.3.4各组大鼠脑含水量及脑梗死大小的测定 给药结束后，将大鼠安乐处死，小心取脑，每组取10只大鼠的大脑，沿冠状位切成2 mm的切片，置于20 g/L 2，3，5-氯化三苯基四氮唑浸泡30 min，使用NIH Image J软件测定大脑梗死面积占皮层面积的百分比，按以下公式计算脑含水量，脑含水量=(湿重-干重)/湿重。

1.3.5Western blot检测NICD、Hes1和Hes5的蛋白表达 给药结束，每组5只大鼠，取大鼠半暗带脑组织，称重置于匀浆器，以1 mL∶100 mg加入预冷的组织细胞裂解液(Lysis Buffer)、5 μL磷酸酶抑制剂、5 μL蛋白酶抑制剂和5 μL PMFS，研磨均匀，4 ℃，10 000 r/min离心10 min，留上清，采用BCA法蛋白定量。加SDS loading buffer煮沸，置于-70 ℃冰箱备用。SDS-PAGE电泳每孔加样40 μg，转膜，脱脂奶粉室温封闭1 h。Notch1 NICD一抗(1∶800)、Hes1(1∶500)、Hes5(1∶800)与内参β-actin(1∶200)4 ℃孵育过夜，二抗(1∶4 000)室温孵育60 min，采用Bio-Rad凝胶成像系统进行ECL化学发光行条带灰度分析。NICD、Hes1和Hes5抗体均购自Santa Cruz公司。

1.3.6RT-PCR检测Hes1和Hes5 mRNA表达 给药结束，每组5只大鼠，取大脑半暗区组织，冰上匀浆。于4 ℃、10 000 r/min离心5 min，取上清加等体积的异丙醇，加入乙醇离心，弃乙醇，干燥沉淀，加Rnase-free溶解，采用分光光度计检测RNA纯度。RT-PCR采用SYSB Premix Ex TaqTM进行。电脑自动分析荧光信号，转换为目的基因拷贝数与CT值，GAPDH为内参，引物序列可见表1。

表1 各基因引物序列

Tab.1 Gene sequences of primer

基因引物序列Hes1上游:5′-AAAGACGGCCTCTGAGCAC-3′下游:5′-GGTGCTTCACAGTCATTTCCA-3′Hes5上游:5′-GAAGGCCGACATCCTGGAGA-3′下游:5′-ACCAGGAGTAGCCCTCGCTGT-3′GAPDH上游:5′-TCGACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3′下游:5′-GCGCCCAATACGACCAAATCC-3′

1.4 统计学处理应用SPSS 17.0软件进行统计学处理。计量资料以“均数±标准差”表示，符合正态分布的资料组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠的体质量、脑含水量及梗死面积的比较

体质量、脑含水量及梗死面积数据符合正态分布。各组大鼠给药前的体质量比较无统计学意义(P>0.05)。治疗后，与对照组相比，模型组体质量降低(P<0.05)；与模型组比，赤芍总苷各组及尼莫地平组体质量有不同程度增高(表2)，赤芍总苷各组体质量呈剂量依赖性趋势。

表2 各组大鼠的体质量、脑含水量及梗死面积的比较

Tab.2 Comparison of rat weight, brain water content and infarct size in each group

组别体质量(g, n=20)治疗前治疗后脑梗死百分比(%, n=10)脑含水量(%, n=10)对照组186.50±12.59244.32±13.510.00±0.0012.81±1.61模型组189.51±15.22192.51±13.90∗29.42±4.21∗35.60±5.62∗赤芍总苷低剂量187.54±13.42200.61±13.4221.61±3.80#30.42±4.21#赤芍总苷中剂量182.40±16.21216.82±13.83#19.52±3.81#24.60±3.82#△赤芍总苷高剂量186.53±14.52225.81±12.92#△17.30±3.41#△23.62±3.12#△尼莫地平184.91±13.50229.61±13.10#△16.82±3.00#△22.10±2.43#△F0.56640.78283.93144.354P0.726<0.001<0.001<0.001

与对照组相比，*P<0.05；与模型组相比，#P<0.05；与赤芍总苷低剂量组相比，△P<0.05。

2.2 各组大鼠脑组织NICD、Hes1和Hes5蛋白的表达经正态性检验，NICD、Hes1和Hes5蛋白表达符合正态分布。与对照组比，模型组NICD、Hes1和Hes5蛋白表达明显增高(P<0.05)；与模型组比，赤芍总苷各组及尼莫地平组NICD、Hes1和Hes5均有不同程度降低(图1)，赤芍总苷各组NICD、Hes1和Hes5变化呈剂量依赖性趋势。

图1 各组大鼠脑组织NICD、Hes1和Hes5蛋白的表达与比较

Fig.1 Expressions of NICD, Hes1 and Hes5 in rat brain tissue of each group

与对照组相比，*P<0.05；与模型组相比，#P<0.05；与赤芍总苷低剂量组相比，△P<0.05。

2.3 各组大鼠脑组织的Hes1和Hes5 mRNA表达情况经正态性检验，Hes1和Hes5 mRNA表达符合正态分布。与对照组比，模型组Hes1和Hes5 mRNA明显增高(P<0.05)；与模型组比，赤芍总苷各组及尼莫地平组Hes1和Hes5 mRNA均有不同程度降低(图2)，赤芍总苷各组Hes1和Hes5 mRNA变化呈剂量依赖性趋势。

图2 各组大鼠脑组织的Hes1和Hes5 mRNA的表达与比较

Fig.2 Expressions of Hes1 and Hes5 mRNA in rat brain tissue of each group

模型组与对照组相比，*P<0.05；与模型组相比，#P<0.05；与赤芍总苷低剂量组相比，△P<0.05。

3 讨 论

赤芍为毛茛科植物芍药(Paeonia Lacti Flora Pall)或川赤芍(Paeonia Veitchii Lynch)的干燥根，是中医常用于治疗心脑血管疾病的药物。赤芍总苷是赤芍的有效成分。研究显示，赤芍总苷具有较强的神经细胞保护效应，进而抑制脑缺血脑水肿的发生[6]，但该效应的机制研究较少。

大量研究显示，Notch信号通路与脑缺血再灌注损伤过程紧密相关，成熟大脑缺血后，脑室下区(SVZ)的增殖细胞Notch信号高表达，Notch 信号通路活性增强可明显增加缺血新生血管数量及血液灌注量，促进缺血性损伤[7]，同时也可调节缺血诱导的神经损伤，γ-分泌酶被激活，释放下游分子NICD、Hes1和Hes5。NICD、Hes1和Hes5表达增高提示缺血后胶质细胞和神经元之间存在细胞间通讯，诱导神经元死亡，通过调节NF-κB、凋亡前体蛋白并加重神经元凋亡。即使短暂性脑缺血，急性期海马CA1区的Notch信号通路被活化，NICD水平增高，神经祖细胞数目增加，Notch信号通路被抑制，神经祖细胞的分化明显增加[8-9]。局灶性脑缺血后，通过-分泌酶抑制剂阻断Notch信号的活性可以起到神经保护作用和抗炎作用[10-11]。本课题结果显示，不同剂量的赤芍总苷可呈剂量依赖性地降低脑组织的NICD、Hes1和Hes5蛋白水平，同期也可以降低脑组织的Hes1和Hes5 mRNA水平。其机制有直接或间接两种[12-13]：①含有赤芍的化湿行瘀清热方可通过阻断Notch信号通路相关蛋白表达，机制尚不明确；②含有赤芍总苷的芍药汤可抑制Notch1和Hes1 mRNA及蛋白表达调控Notch信号通路达到治疗葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎小鼠；③赤芍总苷通过抑制NF-κB p65DNA结合活性及其下游VEGF基因的表达，抑制VEGF与其受体的作用，而Notch的失活状态是受VEGF负反馈调节，达到降减及改善轻梗死炎症反应的效果。

本课题存在的不足：Notch信号转导通路对脑缺血性脑损伤是有害还是保护仍存在争议。本课题结果显示，赤芍总苷可通过抑制局灶性脑梗死大鼠脑组织Notch信号通路而达到保护效果，但研究显示抑制Notch1信号可降低脑室管膜下区增生的细胞，阻滞脑缺血诱导的细胞增殖，可见Notch1信号可能在脑缺血神经再生中起重要作用，因此，仍有必要从脑细胞神经再生角度考察赤芍总苷对局灶性脑梗死的干预效果，为赤芍总苷的临床应用提供参考。

综上所述，赤芍总苷可用于治疗局灶性脑梗死，其机制可能与抑制脑组织Notch信号通路相关。