贾 敏，王 崴，纪 翠，董 倩，马青艳， 冯俊芹，范雅娟，朱 峰，马现仓，高成阁

(1. 西安交通大学第一附属医院精神心理卫生科，陕西西安 710061；2. 西安交通大学医学部，陕西西安 710061)

双相障碍(bipolar disorder, BD)是临床上发病率较高的精神障碍，情感呈现异常高涨或低落状态是其主要临床特征。患者同时产生的认知功能损害已被公认为双相障碍重要的临床特征[1-3]。在不同年龄段、双相障碍的不同分型中及疾病的不同时期，均普遍存在[4-12]。本课题组在前期的研究中已经发现，双相障碍急性发作期患者的肠道菌群多样性增加，肠道菌群的构成及丰度在不同等级上均发生改变[13]。由于认知功能损害已成为双相障碍的重要特征，因此，为进一步探讨双相情感障碍患者肠道菌群的变化与临床症状及认知功能之间的关系，本研究将评估双相障碍患者不同临床相的认知功能，测定双相障碍患者肠道菌群的相对丰度，分析双相障碍患者认知功能与肠道菌群相对丰度的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象病例组：选取2016年4-12月于西安交通大学第一附属医院精神心理卫生科住院的陕西关中地区的患者。入选标准：①经MINI评估，符合ICD-10双相障碍(躁狂相或抑郁相)诊断标准，入院前3个月未服用精神药物；②15岁≤年龄<65岁；③近3个月连续服用抗生素≤3 d；④体质量指数(body mass index, BMI)为17.5～30.0 kg/m2；⑤饮食结构基本相同，无特殊饮食习惯。排除标准：①现患心、肝、肾或胃肠道等躯体性疾病；②符合ICD-10中除双相情感障碍以外的其他精神障碍的诊断标准；③精神疾病阳性家族史。对照组：选取与患者组同期来自同一地区的健康志愿者。入选标准：①15岁≤年龄<65岁；②近3个月连续服用抗生素治疗不超过≤3 d；③BMI为17.5～30.0 kg/m2；④饮食结构基本相同，无特殊饮食习惯。排除标准：①现患心、肝、肾或胃肠道等躯体性疾病；②符合ICD-10中任何精神障碍的诊断标准；③精神疾病阳性家族史。

本研究经西安交通大学医学部第一附属医院伦理委员会批准，伦理批件号：XJTU1AF2015LSL-079。所有受试者入组前均自愿签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1一般资料收集 所有受试者入组当天详细询问病史，并进行体格检查及精神检查，收集一般临床资料，包括性别、年龄、文化程度、身高、BMI、是否吸烟、饮酒习惯、近2周是否饮用乳制品等日常饮食习惯情况(其中乳制品在饮食习惯中对肠道菌群的影响最明显)。

1.2.2量表评估 由1名有丰富临床经验的精神科主治医师使用蒙哥马利抑郁量表(Montgomery Asberg Depression Rating Scale, MADRS)、杨氏躁狂量表(Young Manic Rating Scale, YMRS)和MATRICS共识认知成套测验(MATRICS Consensus Cognitive Battery, MCCB)对双相障碍患者的临床症状及认知功能进行评估，YMRS评分≥13分且MADRS<12分入躁狂组，MADRS≥22分且YMRS<6分入抑郁组。MCCB量表共包含9项测试[14]，评估6个神经认知领域和社会认知领域。①处理速度：包括连线测验、符号编码、范畴流畅；②注意性/警觉性：即持续操作测验；③工作记忆：空间广度；④言语学习和记忆：霍普金斯词语学习；⑤视觉学习和记忆：视觉空间记忆测试；⑥推理与问题解决能力：即迷宫测验；⑦社会认知：情绪管理测验。本研究由于测试条件受限，未对所有患者进行持续操作测验；另有文献报道，MCCB不适用于评估BD患者的社会认知功能[14]：故本研究采用MCCB中的7项测试，包括连线测验、符号编码、霍普金斯词语学习、空间广度、迷宫测验、简易视觉空间记忆测试及范畴流畅评估双相障碍患者的神经认知功能。

1.2.3粪便标本的采集 于入组后3 d内清晨采集所有受试者新鲜粪便标本约10 g于40 mL无菌采便盒内，迅速置于-80 ℃冰箱保存。粪便采集过程均由1名接受过严格无菌操作培训的人员完成。

1.2.4粪便中基因组DNA的提取 粪便采集后1周内采用EZNA. Stool DNA Kit试剂盒(上海索宝生物科技有限公司)完成基因组DNA的提取，取50～100 mg粪便样品经过涡旋5 min，70 ℃水浴10 min，90 ℃水浴5 min，冰上孵化2 min，涡旋2 min，冰上孵化5 min，17 000×g离心5 min，洗脱等步骤提取约200 μL含有DNA的样品，保存于-20 ℃冰箱备用。

1.2.5PCR技术及生物信息学分析 从粪便标本中提取的16S rRNA基因中的V3-V4可变区域片段行PCR扩增，模板DNA 2.5 μL，引物341F：5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′，引物806R：5′-GGA-CTACNNGGGTATCTAAT-3′。对扩增产物纯化后，使用TruSeq®DNA PCR-Free Sample Preparation Kit试剂盒(武汉锦奥科技生物有限公司)行文库的构建：取样本DNA进行保守引物扩增、产物纯化定量、等量混合切胶回收，进行末端修复、加A，接头连接，最后纯化出库。将构建后的文库按照试剂盒说明书应用Qubit和Q-PCR进行质量控制，文库质检合格后，应用HiSeq2500 PE250(美国Illumina公司)行文库上机测序。根据Barcode序列和PCR扩增的引物序列将各样品的数据从下机数据中拆分出来，随后对各样品的reads给予拼接，经过严格过滤处理[15]获得高质量Tags数据(Clean Tags)。利用Uparse软件(Uparse v7.0.1001，http://drive5.com/uparse/)聚类，以97%的一致性将序列聚类成为运算分类单元(operational taxonomic units, OTUs)，筛选出频数最高的序列作为代表序列并进行物种注释，采用Mothur方法与SILVA(http://www.arb-silva.de/)的SSUrRNA数据库[16]进行物种注释分析，设定阈值为0.8～1.0，获得分类学信息和群落组成。应用LEfSe软件(http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/root/index)分析组间相对丰度差异具有统计学意义的菌群。

2 结 果

2.1 一般资料病例组共纳入样本31例，其中躁狂组19例、抑郁组12例；对照组28例。纳入的59例受试者中，因有9例未完成MCCB测试，剔除无效的病例和无效对照后，实际纳入有效样本共50例(有效率84.75%)，其中病例组27例，包含躁狂组17例，抑郁组10例；对照组23例。病例组与对照组的一般人口学特征及饮食情况差异无统计学意义。躁狂组、抑郁组与对照组在性别、年龄、受教育年限、BMI、吸烟和饮酒状况、是否饮用乳酸制品、饮食结构及排便习惯等方面差异均无统计学意义(表1)。

表1 一般人口学资料及饮食情况分析

Tab.1 Analysis of demographic data and dietary status

项 目对照组(n=23)病例组总样本(n=27)躁狂组(n=17)抑郁组(n=10)t/χ2aP值aF/χ2bP值b年龄(x±s,岁)27.43±9.9225.33±6.8026.29±6.0623.70±7.97-0.880.380.690.51受教育年限(x±s,年)12.48±3.0613.04±2.7413.18±2.6012.80±3.080.680.500.280.76BMI(kg/m2, x±s)21.11±1.7021.77±2.6821.61±2.1622.03±3.521.010.320.600.55性别(男/女, 例)15/816/1110/76/40.190.670.190.91吸烟状况(是/否,例)5/1811/167/104/62.060.152.070.36饮酒状况(是/否,例)10/1312/156/116/40.010.951.560.46乳制品(是/否,例)12/1116/1112/54/60.250.622.640.27饮食结构(荤/素,例)11/1216/1111/65/50.650.421.200.55主食比例(≥50%/<50%,例)14/916/1110/76/40.010.910.020.99油炸食品(是/否,例)2/213/242/151/90.080.780.100.95腌制食品(是/否,例)0/231/261/160/100.010.991.980.37排便频率(每天≥1次/每天<1次,例)16/721/613/48/20.440.510.480.79粪便性状(湿软/干硬,例)22/124/315/29/10.130.720.800.67

BMI为体质量数；饮食结构：荤表示荤食(肉、蛋)比例≥50%，素表示荤食(肉、蛋)比例<50%；油炸/腌制食品：是表示食用油炸/腌制食品频率每周≥3次，否表示食用油炸/腌制食品频率每周<3次；a对照组与病例组两组间比较的统计值；b对照组、躁狂组、抑郁组三组间比较的统计值。

2.2 认知功能的比较病例组与对照组认知功能比较：病例组在符号编码(t=-2.20，P=0.03，图1A)、霍普金斯词语学习测验(t=-2.43，P=0.02，图1B)及迷宫测试(t=-2.24，P=0.03，图1C)三方面得分均较对照组降低。躁狂组、抑郁组、对照组认知功能比较：3组在符号编码(F=3.53，P=0.04，图1A)、霍普金斯词语学习(F=6.12，P<0.01，图1B)及迷宫测验(F=3.82，P=0.03，图1C)3项上总体存在差异。组间两两比较显示，在符号编码(t=2.65，P=0.01，图1A)及迷宫测试(t=2.74，P=0.01，图1C)两方面，躁狂组得分均较对照组降低；在霍普金斯词语学习上，抑郁组得分较对照组(t=3.50，P<0.01，图1B)及躁狂组(t=2.40，P=0.02，图1B)降低。

图1 病例组与对照组及躁狂组、抑郁组、对照组3组组间认知功能的比较

Fig.1 Comparison of cognitive function between BD group and control group, and among BDM group, BDD group and control group

A：符号编码；B：霍普金斯词语学习；C：迷宫测验。*P<0.05，#P<0.01。

2.3 肠道菌群相对丰度与临床指标相关性分析

2.3.1肠道菌群相对丰度与人口学特征的相关性分析 现分别在属和种水平，对组间具有统计学差异的菌群相对丰度与年龄、受教育年限及BMI进行相关性分析发现，普通拟杆菌种的相对丰度与年龄呈正相关(r=0.40，P<0.01，图2)。

图2 肠道菌群相对丰度与人口学特征的相关性分析

Fig.2 Correlation between the relative abundance of gut microbiome and demographic characteristics

2.3.2肠道菌群相对丰度与临床症状严重程度的相关性分析 躁狂组患者肠道菌群相对丰度与YMRS总分的相关性分析表明，双歧杆菌种的相对丰度与YMRS总分呈负相关(r=-0.53，P<0.05，图3)。抑郁组患者肠道菌群相对丰度与MADRS总分及各因子分的相关性分析表明，双歧杆菌属的相对丰度与MADRS总分(r=-0.70，P<0.05，图4A)及MADR中的心境恶劣因子分(r=-0.64，P<0.05，图4B)呈负相关，志贺菌属的相对丰度与MADRS的抑制因子分呈负相关(r=-0.66，P<0.05，图4C)。大肠埃希氏菌菌种的相对丰度与MADRS的抑制因子分呈负相关(r=-0.66，P<0.05，图4D)。

图3 肠道菌群相对丰度与YMRS总分的相关性分析

Fig.3 Correlation between relative abundance of gut microbiome and the total score of YMRS

2.3.3肠道菌群相对丰度与认知功能间的相关性分析 躁狂组患者肠道菌群相对丰度与认知功能的相关性分析表明，双歧杆菌种的相对丰度与范畴流畅(r=-0.51，P<0.05，图5)评分呈负相关。抑郁组患者肠道菌群相对丰度与认知功能的相关性分析表明，抑郁组患者肠道菌群中，志贺菌属的相对丰度与范畴流畅评分呈负相关(r=-0.71，P<0.05，图6A)。双歧杆菌种的相对丰度与连线测试(r=-0.75，P<0.05，图6B)，符号编码(r=-0.64，P<0.05，图6C)、空间广度(r=-0.87，P<0.01，图6D)及范畴流畅(r=-0.75，P<0.05，图6E)的评分呈负相关；大肠埃希菌菌种的相对丰度与范畴流畅评分呈负相关(r=-0.71，P<0.05，图6F)。

图4 肠道菌群相对丰度与MADRS各因子分的相关性分析

Fig.4 Correlation between relative abundance of gut microbiome and the factor scores of MADRS

A：双歧杆菌属相对丰度与MADRS总分；B：双歧杆菌属相对丰度与MADRS心境恶劣因子分；C：志贺菌属相对丰度与MADRS抑制因子分；D：大肠埃希菌菌种相对丰度与MADRS抑制因子分。

图5 躁狂组患者肠道菌群相对丰度与认知功能的相关性分析

Fig.5 Correlation between relative abundance of gut microbiome and cognitive function in BDM group

3 讨 论

本研究结果显示，BD患者的信息处理速度、词语学习能力、推理能力和解决问题能力均较健康对照组降低。一项关于应用MCCB评估中国双相障碍患者的认知功能研究发现，重度双相Ⅰ型障碍患者的信息处理速度、注意力、警觉性、工作记忆、词语学习、视觉学习、推理和问题解决能力均较健康人明显受损[17]。本研究也发现，双相抑郁患者的词语学习较健康对照组降低。一项应用MCCB评估中国双相Ⅰ型障碍抑郁发作患者的认知功能研究发现，双相Ⅰ型障碍-抑郁发作患者的视觉学习能力及信息处理速度均较健康对照组降低[18]。这些研究均与本研究结果一致。本研究还发现，双相躁狂患者的信息处理速度及推理和解决问题能力均较健康对照组降低。目前尚缺乏应用MCCB评估双相躁狂患者认知功能的研究。一项关于中国双相躁狂患者认知功能的研究显示，双相躁狂患者的词语学习能力较健康对照组降低[19]。此外，本研究结果还发现，双相抑郁患者的词语学习能力较双相躁狂患者降低，这一结果也与我们临床所观察到的双相抑郁和双相躁狂患者的临床特征相符。总之，本研究结果显示，双相躁狂患者与双相抑郁患者均存在认知损害。

图6 抑郁组患者肠道菌群相对丰度与认知功能的相关性分析

Fig.6 Correlation between the relative abundance of gut microbiome and cognitive function in BDD group

A：志贺菌属相对丰度与范畴流畅；B：双歧杆菌种相对丰度与连线测验；C：双歧杆菌种相对丰度与符号编码；D：双歧杆菌种相对丰度与空间广度；E：双歧杆菌种相对丰度与范畴流畅；F：大肠埃希菌菌种相对丰度与范畴流畅。

本研究最后探讨了在组间存在统计学差异的菌群的相对丰度与人口统计学资料、认知功能及疾病严重程度之间的相关性。结果发现，双歧杆菌种的相对丰度与躁狂的严重程度呈负相关，同时双歧杆菌属的相对丰度与抑郁的严重程度及心境恶劣的严重程度也呈负相关。这一结果提示，双歧杆菌可能在负性情绪及正性情绪的平衡调节中起保护性作用，是一种有益肠道菌群。AIZAWA[20]的研究发现，抑郁症患者肠道菌群中双歧杆菌数量较健康对照组减少，双歧杆菌数量明显减少的抑郁症患者更易发生肠易激综合征。另有研究发现，口服含有双歧杆菌的益生菌可改善抑郁情绪[21]，也提示人类肠道菌群中双歧杆菌含量可能与情绪的变化存在相关性。本研究发现，志贺菌属及大肠埃希菌菌种的相对丰度与双相抑郁患者的抑制症状呈负相关。目前尚缺乏关于此类菌群与情绪症状之间关系的研究，我们需扩大样本量对其进行进一步阐释。

本研究还对BD患者不同临床相的认知功能与肠道菌群相对丰度之间的相关性进行了分析，发现躁狂组患者肠道中双歧杆菌种的相对丰度与信息处理速度呈负相关，抑郁组患者肠道中双歧杆菌种的相对丰度与信息处理速度及工作记忆能力呈负相关。这一结果提示，双歧杆菌可能对双相患者的认知功能有保护性作用。已有动物实验发现，给小鼠喂饲长双歧杆菌1714后，小鼠在物体识别测试和Barnes迷宫测试中的表现提升，表明小鼠的学习和记忆能力提高[22]，提示双歧杆菌对认知功能具有改善作用。最近提出的观念认为，肠道菌群通过肠-脑轴影响宿主认知功能，与神经、免疫、生化和内分泌等因素有关。有研究发现，肠道细菌可产生许多对中枢神经系统有影响的代谢产物，如D-乳酸盐、氨和短链脂肪酸[23]。在伴有认知功能障碍和神经性缺陷的慢性疲劳综合征患者粪便中产生D-乳酸盐的肠球菌属和链球菌属的细菌数量增加，表明D-乳酸盐可能对认知功能有调节作用[24]。此外，一些肠道菌株可以产生γ-氨基丁酸、五羟色胺、多巴胺、肾上腺素、去加肾上腺素、组胺等神经递质，这些神经递质可以通过肠道神经系统传入大脑，进而对认知功能产生正面或负面的影响[25]。本研究发现，抑郁组患者肠道中志贺菌属及大肠埃希菌菌种的相对丰度与患者的信息处理速度呈负相关。目前国内外尚缺乏这两种菌群与认知功能之间关系的研究，本课题组计划在未来的研究中进一步验证这两种菌群与认知功能之间的关系。

综上所述，双相障碍急性发作期患者存在认知功能损害及肠道菌群多样性变化，肠道菌群相对丰度的变化与症状严重程度及认知功能相关。本课题组计划在未来的研究中进一步探讨其间的因果关系。