杨艳艳，程小莉，马小琴，陈 钊，田李芳，高 洁，景兰梅，姚 恬，李秋艳，卢家美，姚纲练，付荣国，王 莉

(西安交通大学第二附属医院肾脏内科，陕西西安 710004)

我国成年人群中慢性肾脏病的患病率高达10.8%，庞大的患者基数和终末期后的医疗资源消耗已造成严重的经济和社会负担[1]。多种原因可引起肾脏结构改变与功能障碍，导致慢性肾脏病。虽然各种慢性肾脏病的临床与病理表现存在差异，但是巨噬细胞(Mφ)浸润是各种慢性肾脏病的普遍特征[2-3]。Mφ与肾小管上皮细胞及细胞外基质相互作用，损伤内皮/上皮屏障，同时产生多种细胞因子和趋化因子以及活性氧等，促进肾脏炎症发生和肾间质纤维化，参与慢性肾脏病的进展[4-6]。Mφ在各类慢性肾脏病的发生发展以及预后中均有一定作用[7]。然而，目前并不清楚不同病理类型慢性肾脏病中的Mφ浸润程度和特点的差异。本研究对此进行观察与分析，探讨Mφ在各种慢性肾脏病发生发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 标本来源2013年9月-2016年3月在西安交通大学第二附属医院肾内科住院并行肾活检的肾脏病患者110例，其中男性61例，女性49例，年龄为12～69岁。另选11例外伤后肾切除患者(排除肾脏原发疾病)肾标本为正常对照。按照世界卫生组织1982年诊断标准，通过肾脏病理检查明确患者的慢性肾脏病诊断。本研究获得医院伦理委员会批准和患者知情同意。

1.2 免疫组织化学染色小鼠抗人CD68一抗，酶标二步法检测试剂盒，均购自北京中杉金桥生物工程有限公司。

肾脏患者活检标本和正常对照肾脏标本行常规石蜡包埋、切片，随后脱蜡至水，抗原热修复处理，30 mL/L H2O2封闭内源性过氧化物酶，100 mL/L羊血清封闭，加入抗CD68一抗(mouse anti-human CD68, 1∶1 000稀释)，室温孵育1 h，PBS清洗后加入酶标二抗，室温孵育1 h，PBS清洗后，加入DAB显色液显色。随后脱水透明，封片后照相观察。

用Image-J图像分析软件测定Mφ浸润面积，计算其与肾组织总面积的百分比，以反映Mφ浸润程度。阴性对照组切片不用CD68抗体孵育，其余步骤同上，用以确定染色的特异性。

1.3 肾组织Masson 染色石蜡切片经常规脱蜡至水，经苏木素作用10 min，流水冲洗数分钟，再经丽春红酸性品红染色8 min，用蒸馏水稍洗，经磷钼酸溶液处理5 min，此时勿洗，直接用苯胺蓝复染5 min，再经10 mL/L冰醋酸处理2 min，然后经950 mL/L乙醇、无水乙醇脱水，二甲苯透明，用中性树胶封片，于光镜下观察。用Image-J图像分析软件测定肾纤维化面积。

1.4 临床指标检测及其与肾Mφ浸润的相关分析患者尿红细胞计数采用显微镜40倍物镜视野下尿沉渣镜检。血白蛋白采用溴甲酚绿法测定。血肌酐和尿素氮分别采用肌氨酸氧化酶法和脲酶紫外速率法测定。24 h尿蛋白定量采用焦酚红法。胱抑素C用免疫比浊法测定。采用Pearson相关分析方法测定患者临床指标与肾Mφ浸润程度的关系。

1.5 统计学分析实验数据采用均数±标准差或中位数(四分位数间距)表示，应用SPSS 20.0软件对实验数据进行方差分析或者Kruskal-Wallis秩和检验，并应用Pearson方法对Mφ浸润程度与肾纤维化进行相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同类型慢性肾脏病患者肾Mφ的浸润情况肾组织CD68免疫染色在每个样本均可见棕黄色阳性细胞，阴性对照切片未见阳性细胞，说明染色特异性强。各类肾脏病中Mφ主要浸润于肾小管间质区域，偶见分布于肾小球毛细血管丛和肾小管管腔，其分布形式与病变部位相关(图1)。

Mφ在肾脏不同病理类型中浸润程度差异有统计学意义，其浸润程度自高向低依次为狼疮性肾炎(0.370±0.109)%、系膜增生性肾炎伴慢性间质或血管病变(0.275±0.132)%、IgA肾病(0.270±0.154)%、糖尿病肾病(0.167±0.072)%、紫癜性肾炎(0.165±0.078)%、膜性肾病(0.148±0.071)%、系膜增生性肾炎(0.124±0.061)%，而正常肾组织为(0.059±0.038)%，阴性对照为(0.023±0.006)%；除系膜增生性肾炎外，其余各种慢性肾脏病中的肾Mφ浸润比例均高于对照组(P<0.01)。各组间比较的结果显示，狼疮性肾炎较其他各种慢性肾脏病Mφ浸润明显增多(P<0.05)，IgA肾病和系膜增生伴慢性间质或血管病变的组间Mφ浸润无统计学差异，但两类疾病较膜性肾病、糖尿病肾病、紫癜性肾炎、系膜增生性肾炎的肾Mφ浸润明显增多(P<0.05，图2)。

图1 不同类型肾疾病患者肾脏CD68的染色情况Fig.1 CD68 staining in the kidneys of patients with different renal diseasesA:正常肾组织;B:系膜增生性肾炎;C:系膜增生性肾炎伴慢性肾间质病变;D:膜性肾病;E:IgA肾病;F:糖尿病肾病;G:紫癜性肾炎;H:狼疮性肾炎:I:阴性对照。标尺为50μm。

图2 不同类型肾疾病的肾组织Mφ浸润程度的比较

Fig.2 The degree of macrophage infiltration in the kidneys of patients with different renal diseases

与正常对照相比，**P<0.01；与系膜增生性肾炎、膜性肾病、糖尿病肾病、紫癜性肾炎等组相比，#P<0.05；与其他肾脏病组相比，△P<0.05。

2.2 不同类型慢性肾脏病患者临床指标与肾Mφ浸润的关系110例不同慢性肾脏病患者的性别分布和尿素氮水平无明显差异，而年龄、尿红细胞计数、24 h尿蛋白定量、血浆白蛋白水平、血肌酐、胱抑素C和肾小球滤过率(eGFR)差异有统计学意义。不同慢性肾脏病患者的血肌酐、尿素氮、胱抑素C和eGFR与肾脏Mφ浸润程度存在相关性，随着Mφ浸润程度的增加，血肌酐、尿素氮、胱抑素C水平逐渐增高，eGFR逐渐下降(表1)。

2.3 不同类型慢性肾脏病患者肾纤维化程度及与肾Mφ浸润的关系Masson染色将肾脏纤维化区域染成绿色，统计绿色区域面积可反映纤维化程度。不同病理类型的慢性肾脏病患者的肾脏纤维化程度差异有统计学意义(P<0.01)。组间分析结果显示，狼疮性肾炎较其他各种慢性肾脏病纤维化程度加重(P<0.05)，IgA肾病、糖尿病肾病和系膜增生伴慢性间质或血管病变三组间纤维化程度差异无统计学意义，但纤维化程度重于膜性肾病、紫癜性肾炎、系膜增生性肾炎(P<0.05)，系膜增生性肾炎与正常肾组织间差异无统计学意义(图3、图4)。慢性肾脏病纤维化程度和Mφ浸润程度的相关性分析发现，二者呈线性正相关关系(r=0.822，P<0.01，图5)。

3 讨 论

肾Mφ浸润是多种慢性肾脏疾病的重要病理特征。本研究进一步证实，在多种肾脏疾病，包括狼疮性肾炎、糖尿病肾病、紫癜性肾炎、IgA肾病、膜性肾病、系膜增生性肾炎，患者的肾组织均有明显的Mφ浸润。虽然多种肾脏疾病存在肾Mφ浸润，但是肾Mφ浸润程度与肾脏疾病类型有着一定的关系。本研究发现，狼疮性肾炎患者的肾Mφ浸润程度明显高于其他类型肾脏疾病，说明狼疮性肾炎更容易引起Mφ浸润。系膜增生性肾炎虽然有明显的肾脏损害表现，但是其肾Mφ浸润程度较小，与正常肾组织差异无统计学意义，这提示系膜增生性肾炎的病理改变对Mφ趋化作用较弱。当系膜增生性肾炎伴发慢性间质或者血管病变时，间质和血管病变引发炎症反应，肾Mφ浸润明显增加。肾Mφ浸润程度取决于肾脏炎症程度和炎症类型，而不同肾脏疾病的发病机制不同，肾Mφ浸润程度也有所不同。

表1 不同类型慢性肾脏病患者的临床指标及各指标与Mφ浸润程度的相关性

Tab.1 The clinical parameters and their relationship with macrophage infiltration in patients with different renal diseases

肾病类型例数年龄(岁)性别(男∶女)尿红细胞/HP尿蛋白(mg/24h)白蛋白(g/L)肌酐(mmol/L)尿素氮(mmol/L)胱抑素C(mg/L)eGFR[(mL/(min·1.73m2)]系膜增生性肾炎941.33±16.646:3144.38±206.024373.80±3173.4631.23±11.0874.71±11.044.75±1.981.01±0.2694.45±29.74系膜增生伴慢性 间质或血管病变1548.47±15.756:9129.65±212.683644.46±2493.7434.13±10.23187.28±216.9612.73±12.051.85±1.5365.75±41.97膜性肾病1746.06±13.7010∶759.82±39.666005.50±3649.5831.20±5.8071.62±21.215.03±1.741.04±0.3197.85±27.68IgA肾病4038.00±18.6419∶21401.04±594.432797.09±2544.5739.67±6.82130.51±101.007.12±3.971.69±1.1874.35±38.24糖尿病肾病652.17±8.804∶249.00±77.735551.37±4649.7933.62±10.2086.86±22.606.77±2.121.43±0.5176.06±24.29紫癜性肾炎1138.82±20.827∶4347.67±496.602421.89±2084.2938.23±7.7666.41±20.165.49±2.061.02±0.15124.05±60.54狼疮性肾炎1227.5±11.719∶391.65±155.693238.17±1981.8329.48±6.19113.60±83.879.44±6.892.16±1.7179.81±45.33组间比较P<0.01NSP<0.05P<0.01P<0.01P<0.05NSP<0.01P<0.01与Mϕ浸润相关性NSNSNSNSNSr=0.459P<0.01r=0.328P<0.01r=0.489P<0.01r=-0.400P<0.01

数据为平均值±标准差，NS为差异无统计学意义。

图3 不同类型肾疾病的肾组织Masson染色情况Fig.3 Masson staining of the kidneys of patients with different renal diseasesA:正常肾组织;B:系膜增生性肾炎;C:系膜增生性肾炎伴慢性肾间质病变;D:膜性肾病;E:IgA肾病;F:糖尿病肾病;G:紫癜性肾炎;H:狼疮性肾炎:I:阴性对照。标尺为50μm。

本研究发现，肾Mφ浸润程度与患者的血肌酐、尿素氮、胱抑素C水平呈正相关，与肾小球滤过率呈负相关，说明肾Mφ浸润程度总体上与肾脏疾病患者的肾功能损害程度相一致。有研究表明，在IgA肾病患者中，IgA肾病分级程度越高，肾损伤越严重，肾Mφ浸润程度也最严重，预后越差[8-9]。本研究对几种不同类型的肾脏疾病的研究进一步证实，肾Mφ浸润程度与肾功能损伤严重程度相关。肾Mφ浸润与肾损伤之间是一个相互促进的过程。肾损伤越严重，引发的炎症反应越剧烈，释放细胞因子趋化单核细胞的作用越强，造成肾Mφ浸润程度越严重[10]。另一方面，Mφ通过释放促炎症和促损伤因子，进一步造成组织细胞损伤[11]。本研究虽然证实肾Mφ浸润与肾功能损害在不同肾脏疾病存在相关性，但是肾Mφ在各种不同肾疾病发生发展中的作用仍有待在模型动物等研究中进一步阐明。

图4 不同类型肾脏疾病的肾组织Masson染色结果的比较

Fig.4 Analysis of renal Masson staining of patients with different renal diseases

与正常对照组相比，**P<0.01；与系膜增生性肾炎、膜性肾病、紫癜性肾炎等组相比，#P<0.05；与其他肾脏病组相比，△P<0.05。

图5 肾Mφ浸润面积和肾纤维化程度的相关性

Fig.5 Correlation between the area of renal macrophage infiltration and renal fibrosis

本研究表明，肾Mφ浸润程度与肾纤维化程度呈正相关。肾Mφ在肾纤维化中起着两方面的作用：一方面肾Mφ可通过转化生长因子-β(TGF-β)、金属蛋白酶(MMPs)、白细胞介素等因子加重肾纤维化[12-14]；另一方面，肾Mφ可吞噬死亡的组织细胞，分泌生长因子，促进组织的修复，减轻纤维化，这在疾病后期转归中十分重要[15]。目前认为，不同表型Mφ分别参与促进和抑制纤维化的过程[16]。肾Mφ浸润程度与肾纤维化程度呈正相关，这提示肾Mφ在本研究的各种肾疾病患者肾脏中主要参与了纤维化过程，与患者疾病处于发病活跃期而非转归期有关。当肾纤维化发生后，肾功能难以逆转，因此，减轻肾纤维化对疾病预后十分关键。在疾病发生发展的早期，减少Mφ浸润有望减轻肾纤维化，改善疾病预后。已有研究证实，去除Mφ可减轻肾纤维化[17]；诱导Mφ表型变化，促进其组织修复能力，也可有效减轻肾纤维化[18]。本研究中，多种肾脏疾病肾Mφ浸润与肾纤维化程度呈正相关，这提示减少肾Mφ浸润对多种肾脏疾病的预后均有益处。

总之，本研究在多种肾脏疾病中，明确了肾Mφ浸润的情况和其与肾功能损伤、肾纤维化的相关关系，指出肾Mφ浸润程度在不同肾脏疾病存在一定的差异，这种差异原因仍有待今后明确。本研究结果表明，肾Mφ浸润程度与肾纤维化的正相关关系，为抑制肾Mφ浸润以改善疾病预后提供了依据。但本研究的主要不足是未能明确肾Mφ的具体表型，这需要在今后继续研究，从而加深认识Mφ参与肾功能损害的机制。