崔美林，于有伟

(山西师范大学 食品科学学院，山西 临汾，041004)

菱角(Trapaspp.)，又名乌菱、水栗等，系一年生蔓性水生草本，是我国传统的食用蔬果，已有3 000多年的栽培历史[1]。菱角果肉含有淀粉、蛋白质、多种维生素及矿物质，同时还富含黄酮、皂苷、多酚等活性物质[2-4]，研究发现，菱角果肉具有“消渴、利尿、益精气”、以及抗肿瘤、抗感染、降血糖等重要的药理活性[5]。目前，菱角的食用与加工均以果肉为主，菱壳作为菱角果实的外种皮，常在加工中作为副产物被弃。然而，大量的研究发现，菱壳中含有多糖、多酚、皂苷、生物碱等活性物质[6-7]，具有抗氧化、抑菌、抑制肿瘤、保肝等功效[8-9]，具备潜在的研究及利用价值。

本文以菱角果肉与果壳作为研究对象，分别对其醇溶性提取物及水溶性提取物的主要成分进行检测，并对相应的抗氧化能力进行分析比较，旨在为菱角果壳、果肉的综合利用奠定更充足的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菱角，市售。

标准品：芦丁、没食子酸、人参皂苷(纯度≥98%)，成都曼思特生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，东京化成工业株式会社；大豆卵磷脂、TBA、Tris、BHA、香草醛、福林酚，北京索莱宝；葡萄糖、FeSO4、NaOH、苯酚、NaNO2、Al(NO3)3、高氯酸、FeCl3、铁氰化钾、冰乙酸、水杨酸、无水乙醇、三氯乙酸、焦性没食子酸等(均为国产分析纯)，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

KQ5200DB型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；JA26038电子天平，上海精科天美仪器有限公司；752N紫外可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；HH-4数显恒温水浴锅，江苏荣华仪器制造有限公司；DGX-90973B-1型电热鼓风干燥箱，上海福玛实验设备有限公司；台式高速离心机，上海卢湘仪仪器有限公司；高速多功能粉碎机，永康市展帆工贸有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品提取液的制备

将菱角洗净，果壳、果肉分离，分别于60 ℃干燥至恒重后研磨成粉末状，过100目筛后于4 ℃冷藏备用。

分别称取果壳、果肉样品粉末3 g，以料液比1∶30 (g∶mL)加入甲醇，于40 ℃下超声辅助提取20 min，离心取上清液定容至100 mL，即得果壳、果肉的醇溶性提取物。同时，分别称取果壳、果肉样品粉末3 g，以料液比1∶30(g∶mL)加入蒸馏水，于70 ℃下超声辅助提取30 min，离心取上清液定容至100 mL，即得果壳、果肉的水溶性提取物。

1.3.2 活性成分含量的测定

分别取适量的菱角果壳、果肉醇溶性提取物样品溶液，利用硝酸铝显色法测定其黄酮含量[10-11]，香草醛-高氯酸法测定皂苷含量[12-14]，福林酚法测定多酚含量[14]，并利用公式(1)分别计算各活性物质含量。

分别取适量的菱角果壳、果肉水溶性提取物样品溶液，利用苯酚-硫酸法测定其多糖含量[15]，并利用公式(1)计算多糖含量。

(1)

式中：E，样品中黄酮(或皂苷或多酚或水溶性多糖)的含量，mg/g；C，经吸光度值计算得出的黄酮(或皂苷或多酚或水溶性多糖)质量浓度，mg/mL；V1，测定体系的体积，mL；V，样品提取液(醇溶性提取物或水溶性提取物溶液)总体积，mL；V2，测定时所取样品提取液的体积，mL；W，样品质量，g。

1.3.3 抗氧化能力的测定

分别取适量的菱角果壳、果肉醇溶性提取物与水溶性提取物，测定DPPH自由基清除能力、抗脂质过氧化能力、清除羟自由基能力、清除超氧阴离子自由基能力、FRAP、以及还原力，并以BHA、抗坏血酸作为对照，综合评价果壳、果肉醇溶性提取物与水溶性提取物的抗氧化能力。

1.3.3.1 DPPH自由基清除能力的测定

分别量取不同体积果壳和果肉的醇溶性和水溶性提取液，用溶剂补足至2 mL，DPPH清除能力测定参照BANGOUR等[16]方法，清除率计算方法如式(2)：

(2)

式中：Ai，2 mL DPPH溶液+2 mL样品溶液；Aj，2 mL无水乙醇溶液+2 mL样品溶液；A0，2 mL DPPH溶液+2 mL无水乙醇溶液。

1.3.3.2 抗脂质过氧化能力的测定

分别量取不同体积果壳和果肉的醇溶性和水溶性提取液，用溶剂补足至1 mL，抗脂质过氧化能力测定参照李颖畅等[17]方法，抑制率计算方法如式(3)：

(3)

式中：AS，样品添加各试剂处理后所测得的吸光值；AC，样品溶剂代替样品，添加各试剂处理后所测得的吸光值。

1.3.3.3 清除羟自由基能力的测定

分别量取不同体积果壳和果肉的醇溶性和水溶性提取液，用溶剂补足至2 mL，清除羟自由基能力参照GAO等[18]方法，清除率计算方法如式(4)：

(4)

式中：Ai，样品溶液添加各试剂处理后测得的吸光值；Aj，用水代替H2O2测得的吸光值；A0，用样品溶剂代替样品，添加各试剂处理后测得的吸光值。

1.3.3.4 清除超氧阴离子自由基能力的测定

分别量取不同体积果壳和果肉的醇溶性和水溶性提取液，用溶剂补足至1 mL，清除超氧阴离子自由基能力参照寇娟妮等[19]方法，清除率计算方法如式(5)：

(5)

式中：△A，样品溶液添加各试剂处理后在在325 nm波长处每反应30 s测一次吸光值，反应5 min，所得到的斜率；△A0，以样品溶剂代替样品，测定邻苯三酚的自氧化速率。

1.3.3.5 FRAP的测定

分别量取不同体积果壳和果肉的醇溶性和水溶性提取液，用溶剂补足至1 mL，参照朱明明等[20]方法测定FRAP，根据吸光度的值，在FeSO4的标准曲线上求相应的FeSO4摩尔数(μmol)，表征为FRAP值，FRAP值越强，表示抗氧化性越强。

1.3.3.6 还原力的测定

分别量取不同体积果壳和果肉的醇溶性和水溶性提取液，用溶剂补足至2 mL，铁还原力测定参照铁氰化钾法[21]，以吸光值表征铁还原能力，吸光值越高表明还原力越强。

2 结果与分析

2.1 活性成分的含量

分别提取菱角果壳与果肉中醇溶性物质与水溶性物质，并对其所含的主要活性成分进行测定，结果如图1所示。

图1 菱角不同部位不同提取条件下活性成分的含量Fig.1 The content of active components in different parts of water chestnut in different extraction conditions

如图1所示，菱角果壳、果肉的醇溶性提取物和水溶性提取物中主要活性成分的含量有明显差异，在对醇溶性提取物的测定中发现，果壳中皂苷、多酚、黄酮的含量分别为(31.18±2.33)、(189.52±5.31)、(56.12±2.98)mg/g，各含量均要显著高于果肉，其中，果肉醇溶性提取物中各值分别为(8.57±0.92)、(33.11±1.95)、(3.05±1.45)mg/g。在对水溶性提取物的测定中发现，果壳与果肉中多糖含量分别为(139.72±4.22)、(123.43±2.85)mg/g。此外还可知，相同质量菱角果壳的醇溶性提取物中的3种主要活性成分的含量梯度为多酚>黄酮>皂苷；而相同质量菱角果肉的醇溶性提取物中的3种主要活性成分的含量梯度为多酚>皂苷>黄酮。结果证明，菱角果壳含有丰富的活性物质，可为其进一步回收利用、深入开发提供理论依据。

2.2 菱角果壳、果肉的醇溶性与水溶性提取物抗氧化活性比较

在本试验的操作中，分别称取果壳、果肉样品粉末3 g，以料液比1∶30(g∶mL)加入甲醇(或蒸馏水)，超声辅助提取后，离心取上清液定容至100 mL，即得果壳、果肉的醇溶性提取物(或水溶性提取物)。即可知,果壳醇溶性提取物中皂苷、多酚、黄酮的质量浓度分别为(0.94±0.07)、(5.69±0.16)、(1.68±0.09)mg/mL；果壳水溶性提取物中多糖的质量浓度为(4.19±0.13)mg/mL；而果肉醇溶性提取物中皂苷、多酚、黄酮的质量浓度分别为(0.26±0.03)、(0.99±0.06)、(0.09±0.04)mg/mL；果肉水溶性提取物中多糖质量浓度为(3.70±0.09)mg/mL。

现分别取菱角果壳、果肉醇溶性提取物、水溶性提取物0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL进行各抗氧化能力指标检测。

2.2.1 DPPH自由基清除能力比较

由图2可知，菱角果壳、果肉的醇溶性提取物与水溶性提取物对DPPH自由基具有较强的清除能力，且随着底物添加量的增加呈上升趋势。对于果壳醇溶性提取物而言，当底物添加量由0.04 mL增至0.1 mL时，清除率从(70.87±1.15)%增至(99.01±1.46)%，并逐渐趋于稳定。同时我们发现，当底物添加量大于0.2 mL时，4种提取物对DPPH清除率均可达到85%以上，表现出良好的清除能力。此外，综合评价可知，清除能力的强弱基本体现为果壳醇溶性提取物>果壳水溶性提取物>果肉醇溶性提取物>果肉水溶性提取物。

图2 提取物添加量对DPPH自由基清除能力的影响Fig.2 Effect of different addition of extracts on the free radical scavenging ability of DPPH

2.2.2 超氧阴离子自由基清除能力的比较

由图3可知，菱角果壳、果肉的醇提物与水提物对超氧阴离子自由基均具有清除能力，且表现出梯度依赖性。对于果壳的醇溶性提取物与水溶性提取物而言，当底物添加量增至0.8 mL时，清除率分别可达(97.46±2.23)%、(95.38±2.65)%。而且我们发现，果壳醇溶性提取物和果壳水溶性提取物对超氧阴离子自由基的清除能力明显大于果肉。清除能力的强弱基本体现为：果壳醇溶性提取物>果壳水溶性提取物>果肉醇溶性提取物>果肉水溶性提取物。

图3 提取物添加量对超氧阴离子自由基清除能力的影响Fig.3 Effect of different addition of extracts on the scavenging ability of superoxide anion free-radical

2.2.3 抗脂质过氧化能力的比较

由图4可知，由亚铁离子引发的卵磷脂脂质体系中，菱角果壳、果肉的醇溶性提取物与水溶性提取物对脂质的过氧化均具有明显的抑制作用。对于果壳醇溶性提取物与水溶性提取物而言，当底物添加量为0.2 mL时，抑制率分别为(76.06±1.69)%、(63.78±1.54)%，且随着底物的增加抑制率趋于平缓，当底物添加量为0.8 mL时，抑制率分别可达(85.34±0.94)%、(84.27±1.85)%。而且果壳醇溶性提取物和果壳水溶性提取物的抗脂质过氧化能力明显大于果肉。抗脂质过氧化能力的强弱基本体现为果壳醇溶性提取物>果壳水溶性提取物>果肉醇溶性提取物>果肉水溶性提取物。

图4 添加不同提取物对脂质过氧化能力的影响Fig.4 Effect of different addition of extracts on on lipid peroxidation ability

2.2.4 FRAP的比较

由图5可知，菱角果壳、果肉的醇溶性提取物与水溶性提取物对亚铁离子均具有还原能力。对于果壳醇溶性提取物与水溶性提取物而言，当底物添加量为0.1 mL时，FRAP值分别为(0.503±0.017)、(0.472±0.014)，且随着底物的增加,抑制率趋于平缓，当底物添加量为0.8 mL时，FRAP值分别为(0.516±0.015)、(0.518±0.021)。FRAP强弱基本体现为：果壳醇溶性提取物>果壳水溶性提取物>果肉醇溶性提取物>果肉水溶性提取物。

图5 添加不同提取物的亚铁还原能力Fig.5 The ferrous reduction ability of different addition of extracts

2.2.5 羟自由基清除能力的比较

由图6可知，菱角果壳、果肉的醇溶性提取物与水溶性提取物对羟自由基均有一定的清除能力，且呈现剂量依赖性。对于果壳醇溶性提取物与水溶性提取物而言，当底物添加量为0.8 mL时，清除率分别可达(31.12±1.29)%、(27.71±1.66)%；并且，果壳醇溶性提取物和果壳水溶性提取物对超氧阴离子自由基的清除能力明显大于果肉。清除能力的强弱基本体现为,果壳醇溶性提取物>果壳水溶性提取物>果肉醇溶性提取物>果肉水溶性提取物。

图6 添加不同提取物对羟基自由基清除能力的影响Fig.6 Effect of different addition of extracts on the scavenging ability of hydroxyl radical

2.2.6 还原力的比较

电子的转移与抗氧化剂的还原力有密切关系，良好的电子供体会使铁离子还原为亚铁离子，溶液的颜色发生改变，可通过显色反应来判断还原的程度，反应后吸光度越大，表示还原能力越强。由图7可知，菱角果壳、果肉的醇溶性提取物与水溶性提取物的还原力随底物添加量的增加而增强。对于果壳醇溶性提取物与水溶性提取物而言，当底物添加量为0.2 mL时，吸光值分别为(2.67±0.13)、(2.66±0.19)，且随着底物的增加,吸光值趋于平缓。并且，果壳醇溶性提取物和果壳水溶性提取物对超氧阴离子自由基的清除能力明显大于果肉。还原力的强弱基本体现为果壳醇溶性提取物>果壳水溶性提取物>果肉醇溶性提取物>果肉水溶性提取物。

通过上述试验结果可知，菱角果壳、果肉的醇溶性提取物和水溶性提取物的抗氧化能力呈现明显差异。主要原因在于：果壳醇溶性提取物中黄酮、多酚、皂苷含量要明显高于果肉，同样，果壳水溶性提取物中的多糖含量也要明显高于果肉，同时，林秋生在研究中也指出，对于菱角果壳而言，甲醇提取物的活性要明显高于水提取物[5]；此外，菱角果壳中还含有具有抗氧化性的生物碱和甾醇类化合物[22-23]。

图7 添加不同提取物的提取液的还原力Fig.7 The reduction ability of of different addition of extracts

综上所述，菱角醇溶性提取物的抗氧化性要强于水溶性提取物，果壳提取物的抗氧化性也要明显强于果肉，整体表现为果壳醇溶性提取物>果壳水溶性提取物>果肉醇溶性提取物>果肉水溶性提取物。

3 结论

本试验通过比较果壳、果肉中主要的醇溶性物质与水溶性物质，得知果壳醇溶性提取物中皂苷、多酚、黄酮的含量均要显著高于果肉，果壳水溶性提取物中多糖含量也要高于果肉。继而对果壳、果肉中醇溶性提取物与水溶性提取物的抗氧化能力进行分析，结果显示，各条件下的提取物对DPPH自由基、超氧阴离子自由基有较强的清除能力，对羟自由基也具备一定的清除能力，对脂质过氧化有较高的抑制作用，同时还具有较强的还原力和亚铁还原能力，表明菱角果壳、果肉具备良好的抗氧化能力。同时研究还发现，菱角果壳提取物的抗氧化性明显强于果肉，且醇溶性提取物较水溶性提取物的抗氧化性更强。该研究可为菱角的深入加工，尤其是菱壳回收再利用——“变废为宝”提供重要的理论依据。