张越 孙泽坤 骆衡 戴仁怀

摘 要：为了探究中华真地鳖血淋巴对癌细胞（PC3、HEL、WM9、MDA-MB-231）体外生长的影响。采用穿刺法收集地鳖虫血淋巴及MTT法研究中华真地鳖血淋巴的抗癌活性，同时用倒置显微镜观察细胞形态学变化，Hoechst 33258染色法检测细胞凋亡，进一步确定中华真地鳖血淋巴对HEL红白血病细胞的抑制作用。结果表明，中华真地鳖血淋巴对四种癌细胞均有体外抑制作用，且对HEL细胞具有明显的抑制作用，呈现明显的剂量依赖关系。

关键词：中华真地鳖;血淋巴;抗癌活性

中图分类号：R73-74

文献标识码：A

文章编号：1008-0457（2019）01-0048-03 国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2019.01.009

中华真地鳖（Eupolyphaga sinensis Walker）属蜚蠊目，鳖蠊科，是一种重要的药用昆虫[1]。其干燥体是中药中一种常用的保健品[2]，含有蛋白质、氨基酸、不饱和脂肪酸等营养丰富的成分[3]。雌虫可以入药，具有消肿散结，下乳通经等功效[4]。此外，多项研究表明地鳖虫提取物具有抗血栓[5-7]、抗肿瘤[8-9]和抗氧化活性[10]等作用。

昆虫血淋巴是淋巴液和血液的混合物，在昆虫的防御、免疫应答等方面起着重要作用，近年来已成为昆虫研究中最常用的研究材料之一[11]。杨佳琪等[12-13]发现九香虫（Aspongopus chinensis Dallas）血淋巴能显著抑制乳腺癌MCF-7细胞的生长，且能通过线粒体凋亡途径诱导乳腺癌MCF-7细胞、人胃癌SGC-7901细胞发生不可逆的凋亡。研究人员也发现经诱导的中华真地鳖血淋巴具有明显的抑菌效果[14]。因此，本实验采用MTT法检测中华真地鳖血淋巴分别对人前列腺癌PC3细胞、人红白血病HEL细胞、人黑色素瘤WM9细胞、人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的抑制作用，用Hoechst 33258染色法检测血淋巴刺激后的细胞凋亡情况，旨在为进一步研究地鳖虫抗癌活性提供依据和参考。

1 材料与方法

1.1 试剂

胎牛血清（FBS）购于四季青公司（中国，杭州），RPIM-1640细胞培养基购于HyClone公司（美国），青链霉素、MTT和DMSO试剂试剂购自索莱宝公司（中国，北京），细胞Hoechst 33258凋亡检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所（中国，上海）。

1.2 主要仪器

多功能酶标仪SYNERGY-H4（美国，Biotek）;尼康倒置显微镜、荧光显微镜（日本，Nikon）;细胞恒温培养箱FormaTMⅡ3110系列水套CO2培养箱（美国，Thermo scientific）;Allegra X-15R 台式冷冻离心机（美国，BECAKMAN）。

1.3 细胞株及细胞培养

人前列腺癌细胞PC3、人红白血病细胞HEL、人黑色素瘤细胞WM9、人乳腺癌细胞MDA-MB-231是从贵州省中科院天然产物化学重点实验室（贵州，贵阳）获得，用含10%牛胚胎血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPIM-1640培养基，在37℃、5%CO2饱和湿度下常规培养，取处于对数生长期的细胞用于后续实验。

1.4 地鳖虫血淋巴提取

中华真地鳖成虫购于山东济宁，用灭菌水擦拭其身体后，通过穿刺法收集中华真地鳖的血淋巴粗提物，通过高速冷冻离心（12000 rpm，4℃，30 min），用0.22 μm滤膜过滤之后获得较为纯净的血淋巴用于活性检测。

1.5 MTT分析

MTT法检测细胞存活率：以每孔5103个细胞接种于96孔培养板上，待细胞过夜生长后分别加入不同浓度的血淋巴，设置复孔5个。在37℃、5%CO2浓度的CO2培养箱中培养48 h。在培养结束后，加入MTT溶液20 μL，在37℃培养箱中继续孵育4 h，高速离心后倒掉孔内的上清液，加入150 μL DMSO，振荡10 min，490 nm波长测定光吸收值（OD值）。设加缓冲液为对照。据公式计算（细胞存活率=实验组光吸收值/对照组光吸收值×100%）计算癌细胞的存活率。

1.6 Hoechst 33258染色

以每孔5105个细胞接种于6孔板上，加入不同浓度的血淋巴，处理24 h。随后将细胞收集进EP管中，用PBS洗两次，按照Hoechst 33258 试剂盒指示检测血淋巴处理后细胞核固缩情况。染色细胞核立即在荧光显微镜（日本，尼康公司）下拍摄。

1.7 数据统计分析

使用SPSS 21 统计学软件对数据进行t检验及单因素方差分析（One way ANOVA），以P<0.05为显著性差异，P<0.01为极显著差异。计量数据以均数标准差（mean SD）表示。

2 結果与分析

2.1 地鳖虫血淋巴对4种癌细胞活力的影响

MTT结果显示，不同浓度的地鳖虫血淋巴作用于PC3、HEL、WM9、MDA-MB-231细胞48 h后，细胞活力随着血淋巴浓度增加而减少。在血淋巴浓度为100 μL/mL时，对各细胞抑制最显著，各处理组相对于对照组的细胞活力分别为（26.40±0.72）%、（60.56±1.82）%、（49.72±4.59）%、（54.17±2.30）%，呈现出较好的抑制效果。其中地鳖虫血淋巴对HEL细胞的细胞活力抑制最显著，随着血淋巴浓度增加，细胞活力较其他三种细胞下降更为迅速，表现出对HEL细胞有更强的抑制作用。

2.2 地鳖虫血淋巴对红白血病HEL细胞凋亡的影响

Hoechst 33258为非嵌入性荧光染料，能使活细胞或固定细胞细胞核着色。Hoechst 33258染色结果显示，在经过不同浓度的中华真地鳖血淋巴刺激48 h后的红白血病HEL细胞株，随着作用浓度升高，细胞出现核固缩，胞质浓缩、细胞体积变小，高浓度下出现致密浓染。

3 结论与讨论

癌症是全球第二大导致人类死亡的原因，2018年美国新增有174万癌症病例，61万人死于癌，癌症严重威胁人类的健康[15]。目前化疗药物的疗效较低，副作用仍然居高不下[16-17]。因此，开发新的、毒性更小的抗癌药物仍然是世界范围内药物化学家的一个重要和具有挑战性的目标[18-19]。昆虫占总生物多样性的一半以上，在所有的气候条件的各种极端环境都有它们的身影，促使研究人员在这类节肢动物中寻找新的治疗药物[20]。地鳖虫是一种药用昆虫，已被记载在《中华人民共和国药典》中[21]。现代医学研究证实地鳖虫具有抗氧化性，抗癌等药效[10]。

本实验结果表明中华真地鳖血淋巴能抑制4种供试细胞（人前列腺癌细胞PC3、人红白血病细胞HEL、人黑色素瘤细胞WM9、人乳腺癌细胞MDA-MB-231）的增殖，且呈浓度依赖性，其中地鳖虫血淋巴对HEL细胞的增殖抑制最显著。Hoechst 33258 染色结果显示中华真地鳖血淋巴能诱导红白血病HEL细胞凋亡，随着作用浓度升高，凋亡越明显。

参 考 文 献：

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