史云娇 刘芳 孙芝兰 吴海虹 张新笑 诸永志 卞欢 朱云龙

摘要：本研究从冷鲜藏羊肉中共分离获得40株腐败菌，其中10株为不动杆菌，经结晶紫染色定量检测发现10株不动杆菌均具有中等或强粘附成膜能力。对1株成膜能力最强的不动杆菌A3的成膜特性进行深入分析，发现该菌在培养3 d时生物膜内菌数最高，随后培养5 d至7 d时菌数无显著（P>0.05）变化。扫描电镜、激光共聚焦显微镜观察及胞外多糖质量浓度测定结果表明，该菌形成生物膜的过程中培养1 d到3 d细菌迅速繁殖，培养3 d到5 d，菌体聚集成团，并且此时不可溶性多糖的含量最高，培养7 d时胞外分泌物质减少，生物膜出现解离状态。因此，在藏羊肉加工过程中，针对此菌生物膜抑制的研究可着重关注控制胞外物质的分泌，并且在生物膜未成熟前实施消毒措施，有助于彻底杀灭生物膜内的腐败菌。

关键词：藏羊肉;不动杆菌;生物膜;胞外多糖

中图分类号：s879.2 文献标识码：A 文章编号：1000-4440（2019）01-0195-09

藏羊（Tibetan sheep）又称藏系羊，是分布于中国西藏、青海和甘南等青藏高原地区的主要畜种。藏羊肉具有高蛋白、低脂肪、低胆固醇、肉质鲜嫩、少膻味的特点，故食用价值较高。目前国内外学者对藏羊肉的研究主要集中在营养成分及品质评价等方面，对其加工屠宰中的卫生安全问题研究较少。生物膜又称生物被膜，是微生物抵抗外界不良环境的一种特殊生长方式，自然界中大多数微生物是以生物被膜的形式存在。在食品工厂中几乎所有条件下，大多数致病菌或腐败菌均可以粘附在不同接触材料表面并形成生物被膜，从而对一些消毒剂的处理产生抗性作用，造成食品的交叉污染和周期性污染。在自然界大多数微生物也均可形成生物被膜，给人类公共卫生和食品安全带来极大的威胁。因此，在食品加工过程中如何防止有害微生物形成生物被膜而引起食源性疾病是亟待解决的科学问题。

不动杆菌属细菌（Acinetobacter spp.）是非发酵条件致病菌，是引起医院内感染的致病菌之一。近年来，有大量文献报道了不动杆菌属是肉类食品中的腐败菌之一。张秋勤在对生鲜鸡中主要腐败菌群的研究中发现贮藏前期与贮藏后期优势菌均由不动杆菌、假单胞菌、肉杆菌、气单胞菌和魏斯氏菌构成。Jul等对鸡胴体表面分离的5 920株腐败菌进行分析后发现30.5%为假单胞菌，22.7%为不动杆菌，13.9%为产黄菌（Flavobacterium spp.），12.7%为棒状杆菌（Corynebacterium），20.2%为酵母菌等其他菌群。本研究拟对藏羊肉腐败菌中不动杆菌的污染情况进行分析，并对其生物膜形成特性进行鉴定，然后以1株成膜能力较强的菌株为目标菌株，通过对其成膜后菌数、膜微观结构、膜厚度及胞外分泌物中多糖含量的测定，研究该菌在7 d内的成膜特性，以期为今后藏羊肉加工过程中控制及杀灭该菌的研究提供参考。

2.4.1扫描电镜观察生物膜内菌体的微观状态扫描电子显微镜（sEM）作为研究细菌生物膜的仪器具有高分辨率、高放大倍数、成像清晰的优点，但生物膜在形成时，细菌细胞会嵌入胞外基质，形成厚层结构，SEM有时不能直观地观察到隐藏在基质内的细胞。通过扫描电镜观察不动杆菌生物膜在培养1 d、3 d、5 d、7 d时的微观结构，结果如图3，培养1 d，仅少量单层菌体粘附于孔板底部，此时尚无细菌聚集体形成，但已有少量菌体分泌胞外基质（图4A）;培养3 d，菌体以多层堆叠的形式聚集在一起，且细菌聚集体已经形成，大量菌体被胞外基质包裹（图4B）;培养5 d，菌体数量较第3 d无显著变化，仍层叠为三维立体结构，但已有部分菌体暴露于胞外基质外（图4c）;培养7 d，菌体明显暴露于胞外基质外，且菌体呈损伤、不完整的状态（图4D）。

2.4.2激光共聚焦显微镜观察生物膜的厚度变化

由于SEM观察生物膜中细菌细胞时受到胞外基质的影响，因此采用LIVE/DEAD BacLightTM试剂盒中的荧光染料对生物膜进行染色，进而通过转盘式激光共聚焦显微镜观察生物膜内部包裹的细菌细胞分布状况、生物膜形成的厚度，捕捉到不同培养时间下的图像，获得即时数据。试剂盒中含有2种荧光染料，每种均为荧光探针SYTO-9及碘化丙啶（PI）按照一定比例配制，SYTO-9与PT作为核酸染料染色后，未受损细胞呈现绿色荧光，受损及死亡细胞呈现黄色或红色荧光。在7d的培养周期内不动杆菌生物膜经含有荧光探针的染料染色后可在激光共聚焦显微镜下呈现三维结构，培养1 d后可发现细菌粘附于接触材料表面已明显形成了生物膜的雏形结构，且生物膜中的活菌比例极高，但此时生物膜表面孔洞较多，厚度较薄（图5A）;培养3d后大量的细菌粘附聚集体已经形成，且较为致密，表面平整光滑，同时，生物膜中已出现少量死菌，从CLSM中也可观察出黄色菌体（受损菌）（图5B）;培养5 d，接触材料表面已经被细菌体覆盖，但表面及侧面较第3 d开始出现空隙及裂缝，膜厚度增加，但红黄色荧光增多，此时，活菌比例呈现进一步显著下降趋势（图5c）;培养7 d，生物膜表面及侧面明显出现较多孔洞，呈瓦解状态，且膜的厚度较培养5 d减小，此时红黄色荧光更多，说明菌体损伤死亡严重（图5D）。

通过SEM、CLSM技术相结合，综合两方面获得的信息可以解决SEM不能观察到嵌入胞外基质中的细胞的问题[2引。SEM与CLSM结果相对应，培养3 d时，细菌迅速繁殖，且细胞聚集体相连，小聚集体减少，聚集体间空隙减少，膜表面逐渐光滑且比较致密;培养5 d后，细胞有损伤，红黄荧光增多;培养7 d后，膜厚度明显减少，表面出现大的空隙，且红黄荧光进一步增多，说明细胞损伤死亡严重。

不动杆菌A3生物膜的形成速度较快，在1 d时已经可见有膜结构出现，在扫描电镜及激光共聚焦顯微镜观察结果中，细菌成膜后细胞团之间成紧密的“网状”三维立体结构，成膜性也较好。胞外多聚物（EPS）占生物膜干质量的90%以上，是微生物的自身代谢产物，被认为是构成生物膜骨架的重要物质。本试验中测得研究的不动杆菌多糖质量浓度中可溶性多糖质量浓度高于不可溶性多糖质量浓度，而在刘红艳等在对饥饿状态下粪肠球菌产多糖能力的研究中发现细菌生物膜中水溶性多糖仅作为生长所需底物被利用，而不可溶性多糖则介导细菌对介质表面的粘附和细菌间的共聚。生物膜在形成过程中起主要作用的组分有多糖、蛋白及胞外DNA，胞外多糖是形成成熟生物膜必不可少的成分，因此，试验中通过对胞外多糖含量的变化表示EPS变化，但组成EPS成分的结构变化还需借助傅里叶红外光谱或拉曼光谱。等仪器测定。

3讨论

目前，已有大量研究发现，细菌生物膜的形成是一个动态过程，从细菌的定殖、粘附、聚集到分化成熟直至播散，共经历5个阶段。细菌在粘附48 h后能形成初期的生物膜，在72 h后则逐步变为成熟生物膜。本试验中通过对目标菌株不动杆菌A31 d、3 d、5 d、7 d的培养，监测其生物膜内菌数、膜微观结构、膜厚度及胞外分泌物中多糖含量发现该菌在第3 d时生物膜内菌数可达到最大值，随后培养5d到7 d菌数无显著变化：对其微观结构观察发现，培养1 d时细菌从单层结构逐渐聚集成细胞集团，细胞集团继续聚集形成较大细胞团簇，彼此之间逐渐相连，缝隙及孔洞减少，形成密集结构，膜的厚度增加，在培养3 d时达到最大，7 d时膜厚度减小，部分菌体呈不完整状态。研究结果符合细菌生物膜生长的一般规律。

研究者发现胞外多糖普遍存在于各种环境下形成的生物膜中，而对于不能合成胞外多糖的突变体只能形成短暂的小菌落，难以形成成熟稳定的生物膜。sutherland研究混合菌生物膜结构发现，只要存在能合成胞外多糖的微生物，就能形成成熟稳定的生物膜，且该生物膜结构中还包含大量不能合成胞外多糖的微生物菌株。综上可知，胞外多糖是大多数细菌形成成熟生物膜结构不可或缺的组成部分。本研究发现，不动杆菌A3生物膜在形成过程中，成膜速度较快，胞外分泌物质会在培养3 d时达到最多，将细菌紧紧包裹，7 d时胞外分泌物减少，菌体明显暴露于胞外基质外，生物膜有解离趋势。因此，针对此菌生物膜抑制的研究中可着重关注控制胞外物质的分泌，具体如何控制胞外物质分泌以及抑制生物膜的形成还需后期进一步研究。