梁梁 杜风光 陈嘉山 刘秀花 梁峰

摘 要：小球藻生长速率快、易于培养且能进行光合作用，可作为生物法固碳的优良材料。而CO2作为全球变暖的元凶，如何减少大气中CO2含量已是当今热门话题。但目前对小球藻去除CO2的研究中，大规模培养的较少。因此，本实验以120L玻璃封闭的自制大容器为培养器，以HSM1添加植物激素6-BA 0.5mg/L为培养基，培养时持续通入CO2和空气，通气量为1L/min，CO2的浓度为6.56%，并进行光照、水循环等，对小球藻进行大规模培养。结果表明：小球藻对CO2的去除率最高达24.09%，鲜重为3.624g/L，产油能力为0.14g/L。

关键词：小球藻;大规模培养;生物固碳;生物燃料

中图分类号：Q945 文献标识码：A 文章编号：1003-5168（2019）17-0131-05

Abstract： Chlorella has a high growth rate， is easy to cultivate and can perform photosynthesis， and can be used as an excellent material for biological carbon fixation. CO2， as a greenhouse gas， is the main culprit of global warming. How to reduce CO2 content in the atmosphere is a hot topic today. In the current study of CO2 removal by Chlorella， large-scale cultures are less common. Therefore， in this experiment， a large-scale culture of Chlorella vulgaris was carried out in a 120L glass-enclosed self-made container with HSM1 and phytohormone 6-BA 0.5mg/L as the medium. During the culture， CO2 and air were continuously injected with a ventilation rate of 1L/min and a concentration of CO2 of 6.56%. Light and water circulation were also carried out to culture Chlorella vulgaris on a large scale. The results showed that the highest CO2 removal rate of Chlorella was 24.09%， fresh weight was 3.624g/L， and oil production capacity was 0.14g/L.

Keywords： Chlorella;large-scale culture;biological carbon fixation;biofuel

小球藻（Chlorella）為绿藻门小球藻属普生性单细胞绿藻，是一种球形单细胞淡水藻类，直径3～8μm，内有一个周生、杯状或片状的色素体，是一种高效的光合植物。微藻固碳已经成为消减温室气体排放的新的研究热点[1]。自养型藻类主要依靠CO2和光能生长，在光合作用过程中，藻类吸收CO2，并将其转化为糖、蛋白质、油脂等生物质能。藻类对光量子（太阳能）的吸收转化率可达8%～10%，而一般农作物的光能转化率只有1%～3%[2]。每生产100t微藻，约可吸收利用470t碳元素，可转化掉185t CO2。因此，藻类养殖是控制和减少大气中CO2的一种有效途径[3]。在300mL的小培养容器中，对CO2的去除率为27.69%，固碳量达到256.86mg/（L·h）[4]，而小球藻去除CO2的研究必将迈向大容器、大规模培养。小容器培养与大容器培养中存在许多微小且令人意想不到的问题，这些问题也是在实验的深入研究中所必须要面临的。

对于以消减大气中CO2为目的大规模微藻培养，其主要利用微藻生长速度快、易于培养且能达到较高密度培养的特性来进行本次实验。本实验选用实验室分离纯化的一株小球藻，生长迅速，抗逆性强，且能在杂藻及杂菌中优势生长，可作为CO2减排藻株。以HSM1添加6-BA为其培养基，并在培养过程中，对光照强度、通气量、容器内水循环等进行控制。本文主要分析大容器培养中，每个时期的CO2去除率，并观察其变化，分析变化的内外原因。同时，观察并测量每个时期的生物量，最后将其回收并测量藻内含油量，以为后续生物精炼方向的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验菌株为小球藻，来自于生物精炼河南省工程实验室。本实验的基本培养基为HSM1培养基，其成分为：NH4Cl 0.500g/L，K2HPO4 1.440g/L，KH2PO4 0.720g/L，MgSO4·7H2O 0.020g/L，CH3COONa 2.000g/L，CaCl2·2H2O 0.010g/L，Trace 1mL。其他涉及培养基有以下三种。

BBM培养基：NaNO3 0.250g/L，KH2PO4 0.175g/L，K2HPO4 0.075g/L，MgSO4·7H2O 0.075g/L，CaCl2·2H2O 0.025g/L，NaCl 0.025g/L，Trace 1mL。

DS培养基：NaNO3 0.300g/L，CO（NH2）2 0.150g/L，K2HPO4·3H2O 0.050g/L，FeC6H5O7 0.006g/L，CaCl2·2H2O 0.025g/L，Trace 1mL。

SE培养基：NaNO3 0.250g/L，K2HPO4·3H2O 0.075g/L，MgSO4·7H2O 0.075g/L，CaCl2·2H2O 0.025g/L，KH2PO4 0.180g/L，NaCl 0.025g/L，FeCl3·6H2O 0.010g/L，Fe-EDTA 1mL。

1.2 试验方法

1.2.1 CO2发生器的制作。取两个2L的雪碧空瓶，并贴上A、B标签。A瓶装200g柠檬酸加600mL水，B瓶装200g小苏打加300mL水，摇匀待用。然后取双出口瓶盖两个，并贴上A、B标签。A盖顶部一个口接压力表，另一个口连接B盖，下部接有通到瓶底的管子;B盖一个口连接A盖，其接口下部接有连接斜三角的管子（使其内液体单向流动，即A瓶液体能进入B瓶，B瓶液体不能进入A瓶，且B瓶的气体能进入A瓶），另一个口为出气口，其上接有调节出气量的阀门。

接着盖上瓶盖，挤压A瓶，使其内柠檬酸进入B瓶与小苏打反应;松开A瓶，B瓶气体进入A瓶，所以两瓶气压相等。重复挤压几次后，随着小苏打与柠檬酸反应，内部气压升高，以致挤压不动时，打开出气口5s左右，使B瓶气压降低，A瓶的柠檬酸就会再次进入B瓶，关紧出气口。摇晃B瓶，使其产生更多CO2，待压力表上压力为1.5左右时，出气口接上通往培养器内的管子即可。为了保证安全，在压力表处接上自动泄压阀，也可手动泄压，防止瓶内压力过高。

1.2.2 培养装置的制作。光照：用8条LDE长条灯带环绕在玻璃培养器周围，顶部装上吸顶灯环形替换光源。测得内部光照强度大约为3 000lx。循环：玻璃培养器内部装上两个多功能潜水泵，提供内部的水循环，且保证一定的搅拌效果，防止过多的小球藻沉淀。通气：外部装上超静音增氧泵和CO2发生器，通过橡胶管接入培养器内;每根橡胶管装上止逆阀，防止内部水倒流;培养器内的橡胶管末端接上空气细化器，使气体均匀进入培养器。电源的接通：以上仪器均接于智能控制插座上，可自动控制以上仪器开启和关闭的时间。气密性检查：开启增氧泵，同时集气口接上集气袋，观察集气袋是否有气体进入，正常进入即制作完成。

1.2.3 培养基的选择及改良。用250mL的三角瓶对本实验室小球藻进行培养基的选择及改良实验。本实验用BBM、DS、SE、HSM1四种培养基培养小球藻，对其生长情况及油脂积累情况进行比较，选出最优。同时，用最优培养基添加不同的植物激素2，4-D、6-BA 0.5mg/L，对其生长情况及油脂积累情况进行比较，选出最优作为大容器培养的培养基。

1.2.4 菌种的活化。配制HSM1固体培养基20mL，然后和事先包扎好的10个平板一起放入灭菌锅灭菌。灭过菌之后，在超净工作台中开始倒完平板，待平板凝固后拿出斜面保存着的菌种，进行四区划线。最后，将划好线的平板放入培养箱内培养4～5d。

1.2.5 种子液的配制。配制好HSM1培养基后，对其进行灭菌。灭完菌，待冷却后，拿出之前活化好的平板，在超净工作台中，挑取单菌落接入锥形瓶里的培养基中。将接好的种子液进行光照培养4～5d。

1.2.6 计数接种。对培养了5d的种子液进行计数，并通过计算得出大约接种子液100mL，使得玻璃培养器中的含藻量为105个/mL。

1.2.7 气体的测量。用气体收集袋收集培养器内1min所排出的气体，再利用排水法得出气体的体积。CO2浓度的测量：用收集袋收集培养器内的气体，再用便携红外气体分析仪测量收集袋中气体的CO2浓度。根据气体流量和通入气体与流出气体中CO2的浓度变化算出小球藻对CO2的去除量和去除率[5]。

1.2.8 生物量的测定。浊度法：从玻璃培养器中取小球藻培养液，合理稀释后在680nm下测定其光密度值，以OD680来衡量小球藻的相对生长量。

鲜重法：在玻璃培养器充分搅拌后，取100mL培养液，8 000r/min离心后将上清液倒掉，并将离心管倒置于报纸上，使其水分充分流失，称重。

1.2.9 回收及含油量的测定。将衰亡期的培养液进行沉淀、离心回收，并取10g的鲜菌于离心管中，加入6mol/L盐酸6～8mL，用玻璃棒搅拌均匀，超声波30min后放入沸水浴中水浴1d，取出放到冰中冷却后，加入95%乙醇10mL，用力摇匀，置于冰浴中10min。向离心管中加入5mL石油醚（30～60），5mL乙醚摇匀，4 800r/min，离心4min，小心用吸管吸取醚层液，放入已知重量的试管中（重量记为[m1]）。再加入3ml石油醚（30～60），3mL乙醚摇匀，4 800r/min，离心4min，小心用吸管吸取醚层液，放入同个试管中。在烘箱中由低到高逐渐升温（不要暴沸），至85℃烘箱中干燥1h，取出冷却称重，直到达到恒重，重量记为[m2]，既得小球藻油脂重（g）为[m=m2-m1]，则可算得鲜菌的含油量。

2 結果分析

2.1 不同培养基对小球藻生长和油脂积累的影响

在培养小球藻的过程中，培养基是否合适至关重要。因此，在大规模培养之前，要对培养小球藻的培养基进行选择优化，选出最优培养基，并将其改良成为适合本实验的培养基，然后再开始进行实验。小球藻L4在4种培养基BBM、DS、SE、HSM1中培养，培养10d后小球藻的生长情况如图1所示。图1中OD680为原液稀释10倍的数值。从图1可以看出，以HSM1为培养基能使小球藻迅速生长，且具有较大的生物量。这可能与HSM1含有较大量的NH4Cl和CH3COONa有关，NH4Cl为小球藻提供充足的氮源，而CH3COONa具有缓冲作用，防止培养基过酸而导致藻细胞大量死亡。

小球藻L4在4种培养基BBM、DS、SE、HSM1中培养，培养10d后小球藻的油脂积累情况如图2所示。从图2可以看出，以HSM1为培养基收获的总油脂最多，这与其生物量大有关。因此，本实验室保藏的小球藻适合生长于HSM1培养基中。该培养基能使小球藻在短时间内快速生长，符合培养小球藻去除CO2的实验要求，并能在后期提供生物精炼方向的研究。在以下所有实验中均以HSM1为基础培养基。

2.2 不同植物激素对小球藻生長和油脂积累的影响

小球藻L4以HSM1培养基不加植物激素作为对照，添加植物激素6-BA、2，4-D培养10d，以100mL为培养单位的生长和油脂积累情况如表1所示。

从表1可以看出，在添加2，4-D的培养基中，小球藻的鲜菌重最高，但含油量低;而在添加6-BA的培养基中，虽然鲜菌重比添加2，4-D的培养基低，但含油量高。这主要是因为生物柴油是最常用的生物燃料之一，被公认为理想的可再生能源，因而也被看作为未来主要的能源来源。考虑到后期生物柴油方向的研究，选用HSM1添加植物激素6-BA为大容器培养的培养基。

2.3 大容器培养中小球藻的生物量变化

在以HSM1添加植物激素6-BA 0.5mg/L为培养基，培养时持续通入CO2和空气，通气量为1L/min，CO2的浓度为6.56%，光照强度为3 000lx的大容器培养中，小球藻受多种因素的影响，因此，和锥形瓶培养的结果会有所不同。大容器培养中小球藻的生长情况如图3所示。

图3中OD680为原液稀释10倍的数值。从图3可以看出，其延滞期比锥形瓶培养长了将近1d。因为通入CO2的原因，对数生长期生长情况优于锥形瓶培养。但是，在第6天提前进入了稳定期且OD680处于较低的状态，这可能与内部水循环不充分有关，导致藻体沉淀以及生长不良。

2.4 大容器培养中小球藻对CO2的去除

小球藻在生长过程中会进行光合作用，从而吸收CO2产生O2，达到去除CO2的目的。在120L的大容器培养中，在优化的培养基中通入含6.56% CO2的空气，通气量为1L/min，观察小球藻对CO2的去除情况，结果如图4所示。

图4上是大容器中CO2浓度的变化情况，图4下是CO2去除率的变化情况。从图4可以看出，小球藻在延滞期及对数生长前期吸收的CO2小于放出的CO2，之后对CO2的去除与生长具有一定的相关性。在此培养器中，有一段时间会有阳光直射，内部温度可能会升高，使小球藻的呼吸作用加强。小球藻去除CO2的量最终会反映到生物量上来。随着生物量的增加，颜色的加深，CO2的去除量及去除率逐渐与生长体现出相关性，培养8d时，去除率达到最高24.09%。最后，随着小球藻生长速率减慢，对CO2的去除率逐渐降低。

2.5 大容器培养中小球藻的回收及含油量

因为小球藻具有多方面的价值，因而被广泛应用于美容、医疗保健、生物精炼等行业。在大容器培养中，小球藻的生物量达到一定程度且稳定后，可对其进行回收利用，进行其他方面的检测，从而充分体现小球藻的价值。培养10d，大容器中小球藻的生长已达到相对稳定。生长情况如图5所示。

此时，生物量已达到稳定水平。但是，由于光线原因看起来会是不均匀的，后期将对光照装置进行改良。

回收的方法是先关掉所有设备，使其沉淀2d，去除上清，留取约20L，取出用8 000r/min离心。此收集法获得约200g鲜重，藻体含油量0.14g/L。小球藻藻体油滴的显微拍照如图6所示。

在图（b）中，红色为叶绿素，黄色为生物柴油。可见，大容器培养中小球藻的油脂较为明显，可进一步改进提取油脂的方法。

3 讨论

小球藻的生长繁殖快、抗逆性强、光合作用速率高、易于调控，适合用于生物工程技术方面的研究;同时，小球藻藻体具有很高的利用价值，具有较高的工业化潜力。因此，小球藻对CO2的固定有望成为一种可行性和经济价值较高的CO2固定方法。

小球藻除了可应用于CO2的固定外，因营养丰富，细胞壁极薄，易于消化吸收，在水产养殖方面也具有重要的经济价值;同时，小球藻的油脂含量高，微藻生物柴油是具有广泛发展前景的生物柴油;在污水处理的研究中也有较大的进展等。

本文的研究仅仅是初步探索大规模培养小球藻所面临的一些问题，而要真正深入探究及解决所带来的问题，还需要迎接巨大的挑战。

参考文献：

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[2] Morison J I L， M.T.F. Piedade， E. Müller， et al. Very high productivity of the C4aquatic grassEchinochloa polystachyain the Amazon floodplain confirmed by net ecosystem CO2 flux measurements[J]. Oecologia， 2000 125（3）：400-411.

[3] Chisti Y. Biodiesel from microalgae[J]. Biotechnology Advances，2007（3）：294-306.

[4] Multidisciplinary B – A. BioCO2 - a multidisciplinary， biological approach using solar energy to capture CO2 while producing H2 and high value products[J]. Biomolecular Engineering， 2007（4）：405-413.

[5]杨凯，战景明，高芬芳，等.小球藻用于生物柴油生产的研究进展[J].中国生物工程杂志，2015（11）：99-104.