朱星宇 周燕萍 陆金兰 林上阳 谢辉 夏晨洁 李伟

摘要  目的：建立杜仲不同炮制品（生品、鹽品与炭品）的水提液指纹图谱，从整体水平表征杜仲炮制前后的化学成分变化，为杜仲质量控制提供参考。方法：采用HPLC法，Kromasil 100-5-C18色谱柱，0.3%磷酸水溶液-乙腈为流动相，梯度洗脱，流速为1 mL/min，检测波长为238 nm。建立10批杜仲不同炮制品水提液的指纹图谱，利用中药指纹图谱相似度评价系统（2012A版）计算相似度，同时运用聚类分析（HCA）和主成分分析（PCA）对杜仲炮制前后进行模式识别分析。结果：建立了杜仲不同炮制品的水提液指纹图谱，生品标定了7个共有峰，盐品标定了7个共有峰，炭品标定了8个共有峰，并指认了其中5个共有峰。HCA和PCA模式识别能够明显区分杜仲不同炮制品。结论：HPLC指纹图谱结合化学模式识别能够有效地区分杜仲不同炮制品，为其质量控制研究提供参考。

关键词  杜仲;炮制品;HPLC指纹图谱;化学模式识别;水提液;聚类分析;成分分析

Comparative Study on Fingerprints of Decoctions of Processed Products of Eucommiae Cortex

Zhu Xingyu1，2，3，Zhou Yanping2，3，Lu Jinglan2，3，Lin Shangyang2，3，Xie Hui2，3，Xia Chenjie2，3，Li Weidong2，3

（1 Jiangsu College of Nursing，Huaian，223001，China; 2 Engineering Center of State Ministry of Education for Standardization of Chinese Medicine Processing，Nanjing 210023，China; 3 Key Laboratory of State Administration of TCM for Standardization of Chinese Medicine Processing，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China）

Abstract Objective： To establish the fingerprints of water extracts from different processed products （raw，salt and charcoal） of Eucommiae Cortex to characterize the changes of chemical components before and after processing at the overall level，and to provide reference for the quality control of Eucommiae Cortex. Methods： HPLC method was applied，and Kromasil 100-5-C18 column was used with 0.3% phosphoric acid in water （v/v）-acetonitrile as the elution system in gradient elution mode.The flow rate was 1.0 mL/min and the detective wavelength was 238 nm.Fingerprint Similarity Evaluation System （2012 A edition） was used to establish fingerprints of 10 batches of different processed Eucommiae Cortex products.Meanwhile，Hierarchical Cluster Analysis （HCA） and Principal Component Analysis （PCA） as methods of pattern recognition were applied to give an overall evaluation. Results： The common modes of HPLC fingerprint for different processed Eucommiae Cortex were set up.There were 7 common peaks in crude and salt products，respectively，and 8 common peaks for the charcoal products. Conclusion： The combination of fingerprints and chemical pattern recognition was an effective method for the distinction between different processed Eucommiae Cortex.The results would provide meaning references for quality evaluation of Eucommiae Cortex.

Key Words  Eucommiae Cortex; Processed products; Fingerprint; Chemical pattern recognition; Water extract; Cluster analysis; Component analysis

中图分类号：R284.1 文献标识码：A  doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2019.02.004

杜仲为杜仲科植物杜仲 （Eucommia u1moides  Oliv.）的干燥树皮，性甘，温，归肝、肾经，具有补肝肾，强筋骨，安胎的功效。用于肝肾不足，腰膝酸痛，筋骨无力，头晕目眩，妊娠漏血，胎动不安[1]。现代研究表明，杜仲中主要含有木脂素类、环烯醚萜类、苯丙素类、黄酮类、萜类、多糖类等化学成分，主要具有降压、降血脂、降血糖、抗肿瘤、抗炎、保肝利胆、抗骨质疏松等药理作用[2-4]。

杜仲有3种常见的炮制品：生杜仲、盐杜仲、杜仲炭。中医药理论认为杜仲盐炙后可以增强其补肝肾、强筋骨的功效，起到“盐制入肾”的作用[5]。课题组前期研究表明，杜仲盐炙后可以明显增强其治疗去卵巢大鼠骨质疏松症的作用[6]，此外，生品和盐炙品含药血清均可以促进人成骨细胞增殖和分化的作用，且盐炙后促进作用显著增强，与其所含的环烯醚萜类成分有关[7]。有学者认为杜仲炒炭后的补肝肾，强筋骨功效较生品更佳[8]，且有研究发现杜仲炭具有明显的抗炎作用[9]。前期研究发现，杜仲盐炙后京尼平、京尼平苷和京尼平苷酸质量分数分别降低25%，40%，40%，炒炭后京尼平、京尼平苷和京尼平苷酸质量分数分别降低98%，70%，70%，说明炮制对其化学成分的影响显著[10]。杜仲炮制前后化学成分的改变，必然会导致药效的差异。但是目前关于杜仲不同炮制品的化学成分差异研究多以少量成分含量测定为主[11-12]，而指纹图谱研究多集中于不同产地或杜仲药材的研究[13-14]，缺少对其炮制前后整体化学成分的比较研究。因此本研究采用HPLC技术建立杜仲生品、盐品、炭品的指纹图谱，并结合聚类分析（HCA）和主成分分析（PCA）对杜仲炮制前后进行模式识别研究，以期从整体角度评价杜仲炮制前后的化学成分变化，为其质量控制研究提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 2695高效液相色谱系统（美国Waters公司）;BT25S型十万分之一电子天平（德国Sartorius公司）;AIBOTE电热套（南京予华仪器设备有限公司）;高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）。

1.2 试剂

对照品京尼平苷酸（批号：20180201JNPGS）、咖啡酸（批号：20180320KFS）、京尼平苷（批号：20180201JNPG）、松脂醇二葡萄糖苷（批号：20180120SZCEPTTG）、京尼平（批号：20180120JNP）均购于南京世洲生物科技有限公司，纯度>98%。

色谱级乙腈（上海ANPEL实验器材有限公司）;色谱级磷酸（上海阿拉丁生物科技有限公司）;水为超纯水;其余试剂均为分析纯。

1.3 分析样品

杜仲生品：十批杜仲生品来源见表1，经南京中医药大学陈建伟教授鉴定为杜仲科植物杜仲（ Eucommia u1moides  Oliv.）的干燥树皮。

杜仲盐品：分别称取十批杜仲生品饮片50 g，照2015年版《中华人民共和国药典》四部盐炙法（通则0213）炒至断丝、表面焦黑色，取出，晾凉。

杜仲炭品：分别称取十批杜仲生品饮片50 g，照2015年版《中华人民共和国药典》四部炒炭法（通则0213）用武火炒至表面焦黑色、内部焦褐色，并断丝存性，喷淋清水少许，熄灭火星，取出，晾干。

2 方法

2.1 供试品溶液的制备

取杜仲生品、盐品和炭品粉末（过四号筛）约1 g，精密称定，加入10倍量水浸泡30 min后，武火煮沸，文火煎煮30 min，滤过。药渣再加入8倍量，煎煮20 min，滤过，合并2次滤液，定容至25 mL，过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.2 對照品溶液的制备

分别精密称取京尼平苷酸、咖啡酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、京尼平对照品适量，加入甲醇溶解并稀释，摇匀，得到质量浓度分别为0.168 mg/mL、0.248 mg/mL、0.241 mg/mL、0.174 mg/mL、0.198 mg/mL的混合对照品溶液。

2.3 色谱条件

色谱柱：Kromasil 100-5-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;柱温：25 ℃;体积流量：1 mL/min;流动相：0.3%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱，程序如下：0～15 min，95～90% A;15～25 min，90～85% A;25～35 min，85～83% A;35～50 min，83～80% A;50～55 min，80～75% A;55～65 min，75～65% A;65～75 min，65～5% A;进样量：10 μL;检测波长：238 nm。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度实验

取同一批杜仲生品，按照“2.1项”下制备供试品溶液，按照“2.3项”下条件连续进样6次，以京尼平苷酸为参照峰，计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果表明，各共有峰相对保留时间 RSD 均小于0.8%，相对峰面积 RSD 均小于1.1%，结果表明仪器的精密度符合要求。

2.4.2 重复性实验

取同一批杜仲生品6份，按照“2.1项”下制备供试品溶液，按照“2.3项”下条件进样，以京尼平苷酸为参照峰，计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果表明，各共有峰相对保留时间 RSD 均小于1.5%，相对峰面积 RSD 均小于1.2%，结果表明该方法的重复性符合要求。

2.4.3 稳定性实验

取同一供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h按照“2.3项”下条件进样，以京尼平苷酸为参照峰，计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果表明，各共有峰相对保留时间 RSD 均小于1.3%，相对峰面积 RSD 均小于1.4%，结果表明，样品在24 h内稳定性良好。

2.5 数据分析

采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012 A）分析杜仲炮制前后的HPLC指纹图谱数据。采用Simca14.1统计分析软件进行聚类分析（HCA）和主成分分析（PCA）。

3 结果与分析

3.1 指纹图谱结果与分析

取30批杜仲样品，按“2.1项”下方法制备供试品溶液，按“2.3项”下色谱条件检测，记录色谱图。将数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 A），生成杜仲不同炮制品的对照指纹图谱如图1所示，混合对照品高效液相色谱图如图2所示。其中生品标定了7个共有峰，盐品标定了7个共有峰，炭品标定了8个共有峰，并指认了其中5个共有峰。通过杜仲3种不同炮制品对照图谱可以明显看出，盐品和炭品明显生成了2号峰，生品在2号峰的位置无明显峰。5号峰（咖啡酸）、8号峰（京尼平）在炮制后峰强明显减弱。相似度评价系统采用中位数计算杜仲不同炮制品的水提液的指纹图谱的相似度，其相似度结果见表2。

3.3 化学模式识别

3.3.1 聚类分析（HCA）

将杜仲不同炮制品的匹配峰数据导入Simca14.1统计分析软件进行聚类分析。结果表明，当 t 为800时，杜仲生品、盐品、炭品明显分为3类，其中1～10为炭品聚为一类，11～20为生品聚为一类，21～30为盐品聚为一类。见图4。

3.3.2 主成分分析（PCA）

将杜仲3种炮制品的指纹图谱所有峰面积作为变量，采用Simca14.1统计分析软件对原始数据进行标准化处理后进行主成分分析（PCA）。杜仲生品、盐品、炭品明显分成3类，其中生品之间差异较大，比较分散，经盐炙后差异缩小，经炒炭后分散程度明显缩小，说明炮制过程对杜仲中整体化学式成分产生了显著的影响。由生品到盐品由于炒制的剧烈程度不如由生品到炭品，所以其分散程度由生品到盐品再到炭品逐渐减小。见图5。

4 讨论

本实验建立了杜仲3种不同炮制品（生品、盐品、炭品）的水提液指纹图谱，并对其进行聚类分析及主成分分析。结果发现，杜仲3种不同的炮制品明显聚为3类，且生品的离散度较大，盐品次之，炭品最小，说明炮制过程对杜仲中的化学成分产生了较大的影响，且随着炮制程度的增加使其化学成分更趋于一致。中药在临床使用多入汤剂，指纹图谱研究以有机溶剂提取的方式得到的结果对其临床应用提供参考具有局限性。本实验建立的杜仲水提液指纹图谱不仅可以为其质量控制提供参考，还可为其不同炮制品的临床应用提供参考。

高效液相色谱指纹图谱结合化学模式识别方法中的HCA、PCA分析，能够对不同炮制方法处理的中药饮片之间进行快速聚类鉴别和判别分析[15-16]。 从3种炮制品的对照谱图可以看出，杜仲中的京尼平苷酸、咖啡酸、京尼平苷松脂醇二葡萄糖苷、京尼平在炮制后响应均呈下降趋势，而炮制后在9.1 min和15.5 min附近明显峰响应增加，正是化学成分的改变导致其可以明显聚为3类。本实验建立的杜仲不同炮制品的指纹图谱可以从整体上区别杜仲3种不同炮制品（生品、盐品、炭品），但是有关于具体的化学成分的改变，课题组将通过LC-Triple TOF MS/MS技术进行进一步研究。

综上所述，本实验建立的杜仲不同炮制品指纹图谱结合化学模式识别手段可以从整体上表征杜仲炮制前后的化学成分变化，能够真实的反应杜仲炮制前后的化学成分变化，为其质量控制研究以及药效学变化研究提供参考。

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