气调贮藏对黄桃风味和软化及褐变相关酶的影响

2019-09-06何双李高阳蒋成韩晓磊

现代农业科技 2019年7期

何双　李高阳　蒋成　韩晓磊

摘要以黄桃为试验材料，研究气调贮藏对黄桃风味相关酶（乙醇脱氢酶、酰基转移酶和脂氧合酶）、软化相关酶（多聚半乳糖醛酸酶和内切β-1，4-葡聚糖酶）、褐变相关酶（多酚氧化酶和过氧化物酶）和MDA含量的影响。结果表明，气调贮藏能延缓乙醇脱氢酶活性的降低，抑制酰基转移酶活性的下降，减少脂氧合酶活性的降低，能减少多聚半乳糖醛酸酶活性的上升，抑制内切一β-1，4-葡聚糖酶活性升高，减少黄桃MDA含量的上升，抑制多酚氧化酶和过氧化物酶活性的增加。因此，气调贮藏能缓解黄桃果实风味劣变，减少果实硬度降低，延缓了果实的衰老和褐变，从而延长黄桃的保质期。

关键词黄桃;气调贮藏;风味;软化;褐变;酶

中图分类号 S662.1;TS255.3

文献标识码 1

文章编号 1007-5739（2019）07-0202-04

黄桃含有丰富的胡萝卜素、番茄黄素、番茄红素、Vc、膳食纤维、铁、钙及多种微量元素，营养价值丰富，香气浓郁，美味可口，深受广大消费者喜爱。发展黄桃产业具有可观的经济价值。黄桃不耐贮藏且上市时间集中，恰逢高温时期，在常温下一般只能存放7d左右，可供鲜食期短。采摘后的黄桃果实易发生果肉软化，出现异味和褐变等现象。黄桃属于呼吸跃变型果实，采收后有双呼吸高峰和乙烯释放高峰出现。采用气调贮=藏能有效保持黄桃的品质，达到延长保鲜期的目的2，但气调贮藏黄桃保鲜机理未见报道。现以炎陵黄桃为试验材料，在本人已发表论文《气调贮藏黄桃参数的优化及对品质的影响》的基础上，研究气调贮藏黄桃对风味相关酶（乙醇脱氢酶、酰基转移酶和脂氧合酶）、软化相关酶（多聚半乳糖醛酸酶和内切B-1，4-葡聚糖酶）、褐变相关酶（多酚氧化酶和过氧化物酶）活性的影响，以期为气调贮藏保鲜黄桃提供参考。

1材料与方法

1.1材料与仪器

1.1.1材料。试验黄桃采自湖南省炎陵县，按照《鲜桃》（NY一T586-2002）标准要求，选取成熟度为八成熟、果实大小均匀、着色一致、无机械损失、无病虫害的果实作为试验材料，当天晚上放入湖南省农产品加工所冷藏库实验室，4C预冷，备用。从长沙方罡气体有限公司购买1瓶标准气，气体成分指标是3%（体积分数）氧气.9%（体积分数）二氧化碳。从高桥市场上购买一打20L保鲜袋和绳子，从湖南探源生物科技有限公司购买1-甲基丙烯。

1.1.2仪器。AL204型电子分析天平，DHG-9246A型电热恒温鼓风干燥箱，紫外分光光度计UV-1700。

1.2试验方法

黄桃按照当地传统采收期采收，次日运回实验室，分装于容量20L保鲜袋内，每袋装果约10kg，置于（4.0+0.5）9C的冷库内，24h后用纤维绳封口。每3d将一定量的1-MCP放置于袋内，然后再将之前配好并放置于钢瓶内的N2、CO2、O2混合气体充满袋内，每次重复处理2次，每次充10L气体，以通人10L空气为对照。黄桃气调贮藏参数：3%（体积分数）氧气，9%（体积分数）二氧化碳，1-MCP浓度为30μLL。每3d随机取样2个。

1.3检测指标与方法

1.3.1乙醇脱氢酶（ADH）活性的测定。粗酶液提取：称取约0.2g样品，加入2mLPBS（pH值6.0，0.1mol/L）进行冰浴匀浆。16000r/min，4C离心20min，取上清液置冰上待测。

ADH测定操作：①空白管。在1mL石英比色皿中依次加人100μL蒸馏水、800μL磷酸缓冲液（含DTT、PVPP、EDTA、Triton一X-100）和100μL乙醛溶液，迅速混匀后于340nm测定吸光值变化，分别记录15s和75s时吸光值，分别记为A1和A2。△A空白管=A1-A2。②测定管。在1mL石英比色皿中依次加人100μL上清液、800μL磷酸缓冲液（含DTT、PVPP、EDTA、Triton一X-100）和100μL乙醛溶液，迅速混匀后于340nm测定吸光值变化，分别记录15s和75s时吸光值，分别记为A3和A4。△A测定管=A3-A4。样本质量记为w。

酶活性单位定义：25C中每毫克蛋白每分钟氧化1μmolNADH为1个酶活单位。

计算公式如下：

ADH（μmol/（min.g鲜重））=1.61x（△A测定管一OA空白管）：W1.3.2酰基转移酶（AAT）活性的测定。粗酶液提取：称取约0.1g组织，加入1mL提取液（0.5mol/LTris一HCl，pH值8.0，含PVP、Trixton-100）冰浴匀浆。8000r/min，4C离心10min，取上清液置冰上待测。

AAT测定操作：①工作液的配制。临用前在试剂（乙酰CoA、MgCl2）瓶中加入22.5mL溶液（0.5mol/LTris一HCl，pH值8.0，含正丁醇），充分混匀待用。②试剂DTNB的配制。临用前加无水乙醇1.25mL充分溶解待用。③空白管。在Ep管中加人50μL提取液和900μL工作液，充分混匀，35C反应15min，加人50μL试剂DTNB，充分混匀，25C静置10min，测定412nm处吸光值，记为A空白管。④测定管。在Ep管中加入50μL样本和900μL工作液，充分混勻，35C反应15min，加入50μL试剂DTNB，充分混匀，25C静置10min，测定412nm处吸光值，记为A测定管。OA=A测定管一A空白管。样本质量记为W。

酶活性单位定义：每克组织每分钟催化产生1nmolTNB定义为一个酶活单位。

计算公式如下：

AAT（nmol/（min.g鲜重））=98.04x△A+W

1.3.3脂氧合酶（LOX）活性的测定粗酶液提取：称取约0.1g组织，加入1mL（Na2HPO4.12H2O、NaH2PO4.2H2O、DTT、EDTA、PVPP）溶液进行冰浴匀浆。16000r/min，4C离心20min，取上清液置冰上待测。在试剂亚油酸钠中加人25mLNa2HPO4.12H2O一NaH2P04.2H20溶液（振荡混匀1min），在30C水浴中预热10min以上。对照管：依次在比色皿中加入100μL样本和900μLNa2HPO4.12H2O一NaH2PO4.2H2O溶液，30C反应30min后，记录A对照。测定管：依次在石英比色皿中加入100μL样本和900μL亚油酸钠溶液，30C反应30min后，记录A测定。AA=A测定一A对照。样本质量记为W。

酶活性单位定义：259C中每克组织每分钟催化吸光值变化0.01个单位为1个酶活单位。

计算公式如下：

LOX（U/g鲜重）=33.33x△A+W

1.3.4多聚半乳糖醛酸酶（PG）活性的测定酶液提取：称取约0.1g样品，加人1mL提取液（醋酸一醋酸钠缓冲液，含PVP、DTT）进行冰浴匀浆。16000r/min，4C离心10min，取上清液置冰上待测。测定操作：对照管依次加人煮沸样本100μL和蒸馏水400μL，40C水溶30min，然后再加试剂（3，5-二硝基水杨酸、NaOH、酒石酸钾钠、苯酚、无水亚硫酸钠）500μL;测定管依次加入样本100μL和试剂果胶酸400μuL，40C水溶30min，然后再加试剂（3，5-二硝基水杨酸、NaOH、酒石酸钾钠、苯酚、无水亚硫酸钠）500μL。对照管及测定管均沸水浴5min，冷却，蒸馏水调零，1mL玻璃比色皿测定540nm处吸光值A，△A=A测定管一A对照管。每个测定管设1个对照管。样本质量记為W。

酶活性单位定义：在40C、pH值6.0条件下，每克样本每小时分解果胶酸产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位。

计算公式如下：

PG活性（mg/（h.g鲜重））=2.523x（OA+0.008）+W

1.3.5内切一β-1，4-葡聚糖酶（Cx）活性的测定。粗酶液提取：称取0.1g组织，加入1mL提取液（酸酸一无水醋酸钠溶液）进行冰浴匀浆。8000r/min，4°C离心10min，置冰上待测。测定操作：对照管加入样本50μL和羧甲基纤维素钠溶液500μL，混匀，37C准确水浴2h，再加入DNS试剂（3，5-二硝基水杨酸、氢氧化钠、酒石酸钾钠、重蒸酚、无水亚硫酸钠溶液）1000μL;测定管加入样本50μL和蒸馏水500μL，混匀，37C准确水浴2h，再加入DNS试剂（3，5-二硝基水杨酸.氢氧化钠、酒石酸钾钠、重蒸酚、无水亚硫酸钠溶液）1000μL，对照管和测定管均90C水浴10min，冷却，蒸馏水调零，测定540nm处吸光值A，计算△A=A测定管一A对照管。样本质量记为W。

酶活性单位定义：每克组织每分钟催化产生1μg葡萄糖定义为一个酶活力单位。

计算公式如下：

Cx活力（μg/（min.g鲜重））=14.305x（△A+0.0673）：W1.3.6多酚氧化酶（PPO）活性的测定。粗酶液提取：称取约0.1g组织，加入1mL提取液（KH2PO4、K2HPO4.3H2O溶液，含PVP）进行冰浴匀浆。8000r/min，4C离心10min，取上清液置冰上待测。测定操作：测定管依次加人样本180μL、溶液（KH2PO4、K2HPO4.3H20）720μL和邻苯二酚溶液180μL，对照管依次加人煮沸的样本180μL、（KH2PO4、K2HPO4.3H20）溶液720μL、蒸馏水180μL，然后测定管和对照管均于25C水浴10min后，于95C水浴5min充分混匀，10000r/min，25C离心10min，取上清液，525nm处检测测定管和对照管吸光度。△A=A测定管一A对照管。样本质量记为W。

酶活性单位定义：每分钟每克组织在1mL反应体系中使525nm处吸光值变化0.01为一个酶活力单位。

计算公式如下：

PPO（U/g鲜重）=60x▲A+W

1.3.7过氧化物酶（POD）活性的测定。粗酶液提取：称取约0.1g组织，加人1mL提取液（Na2HPO4.12H2O、NaH2PO4溶液）进行冰浴匀浆。8000r/min，4C离心10min，取上清液，置冰上待测。工作液的配制：在50mL醋酸钠和冰醋酸溶液中加入28μL愈创木酚溶液和19μL过氧化氢，混匀;25C预热10min以上;在比色皿中加入50μL样本和950μL工作液，混匀，记录470nm下1min时吸光值A1和2min后的吸光值A2。计算OA=Ax一A1。样本质量记为W。

酶活性单位定义：1g组织在1mL反应体系中每分钟Axo变化0.01为一个酶活力单位。

计算公式公式如下：.

POD（U/g鲜重）=2000x△A+W

1.3.8丙二醛（MDA）含量的测定。MDA提取：称取约0.1g样本，加入1mL提取液（Na2HPO4.12H2O和NaH2PO4溶液）进行冰浴匀浆.8000r/min，4°C离心10min，取上清液置冰上待测。

测定步骤：①吸取0.6mLTCA、TBA溶液于1.5mL离心管中，再加人0.2mL样本，混匀。②95C水浴中保温30min，置于冰浴中冷却，10000r/min，25C，离心10min。③吸取上清液于比色皿中，测定532nm和600nm处的吸光度，记为As22和A0o0，AA一=As2-A00o样本质量记为W。

计算公式如下：

MDA含量（nmol/g鲜重）=25.8x△A+W

2结果与分析

2.1气调贮藏对黄桃风味相关酶活性的影响

LOX途径是次生物质代谢的一个重要途径，许多研究表明，L0X途径及其产物参与了乙烯的生物合成，并与果实的成熟衰老密切相关。在番茄、苹果、草莓等果实中也有相同的研究报道，并已基本明确这些果品中醛类、醇类、酯类香气物质的合成是由脂肪酸的LOX氧化途径产生。LOX途径中生物活性酶的具体作用为不饱和脂肪酸是LOX底物，生成过氧化不饱和脂肪酸;HPL以LOX的氧化产物为底物，裂解产生醛类物质和含氧酸;醛类物质在ADH作用下生成醇类物质;AAT把醇类物质和相应的酰基辅酶A缩合作用形成酯类物质，

2.1.1气调贮藏对黄桃乙醇脱氢酶（ADH）活性的影响。ADH是生物体内短链醇代谢的关键酶，催化乙醇与乙醛可逆转换，在很多生理过程中起着重要作用。由图1可看出，贮藏前13d，气调贮藏组和对照组果实ADH活性均呈增加趋势。从第13天开始，气调贮藏组和对照组果实ADH活性逐渐降低。在整个贮藏过程中，气调贮藏处理果实ADH活性均高于对照处理，且随着贮c藏时间的延长，差异越来越显著。这充分说明气调贮藏处理提高了果实ADH活性。ADH是将相应底物转化为醇类物质的一种酶。因此，气调贮藏处理果实芳樟醇含量相对较高可能与其果实ADH活性升高有关。

2.1.2气调贮藏对黄桃酰基转移酶（AAT）活性的影响。AAT是多功能蛋白，主要负责催化生物体内各种酰基化和去酰基化反应，在基因表达、代谢和信号传导中具有重要作用4。由图2可以看出，贮藏前13d，对照组果实和气调贮藏组果实AAT活性逐渐提高，这是黄桃后熟的表现。第13天开始，2个贮藏组AAT活性逐渐降低，但对照组降低得更显著，与气调组差距越来越大。AAT参与果实风味物质代谢，与酯类的生物合成有着密切的关系。可见，黄桃果实贮藏后期风味的丧失可能与AAT活性丧失有关。

2.1.3气调贮藏对黄桃脂氧合酶（LOX）活性的影响。脂氧合酶催化不饱和脂肪酸氧化反应，导致膜脂过氧化，是果实采后成熟和衰老过程中重要的酶。该酶以亚油酸和亚麻酸为底物，生成的氧化产物能够导致脂质过氧化，破坏膜完整性，还可以在相关酶的作用下，生成挥发性物质、茉莉酸、乙烯I）。由图3可以看出，在整个贮藏过程中，气调组黄桃脂氧合酶活性比对照组相应高，2个处理组的黄桃果实酶活性在贮藏前期和中期逐漸升高，在第16天达到最高值。在贮藏后期，表现为小幅下降。可见，气调贮藏处理提高了黄桃脂氧合酶的活性，延缓了黄桃在贮藏期间风味物质的劣变。

2.2气调贮藏对黄桃软化相关酶活性的影响

2.2.1气调贮藏对黄桃多聚半乳糖醛酸酶（PG）活性的影响。果胶的组成与含量决定果实的硬度，果胶酶催化果胶的代谢直接影响果实硬度。果胶酶包括果胶酯酶和多聚半乳糖醛缩酶6。PG酶是分解果胶的关键酶，催化果胶分子中x一（1，4）一聚半乳糖醛酸的裂解，其主要作用是PG酶在果实软化期间减弱了果实细胞相互之间的粘合力，细胞从中胶层处分离开来，同时改变细胞壁的伸缩性和可塑性，降低总果胶和原果胶的含量（7-8。由图4可以看出，果实在贮藏期间PG活性基本呈上升趋势，对照均高于气调组。贮藏前期，气调组和对照组的PG活性差异不显著，上升幅度不大，贮藏13d后，对照组PG活性上升速度明显加快，而气调组，上升速度明显不如对照组，导致2组之间PG活性的差距越来越大。结果表明，气调贮藏能减少PG活性的升高，保持果实硬度。

2.2.2气调贮藏对黄桃内切一β-1，4-葡聚糖酶（Cx）活性的影响。Cx主要作用于非晶态纤维素和水溶性纤维素衍生物，随机水解糖苷键，将其分解成葡萄糖、纤维二糖纤维三糖和其他寡聚体。由图5可以看出，2种贮藏处理组对黄桃果实的CX活性变化趋势基本一致，对照果实与气调贮藏果实都在贮藏至第13天时出现了CX活性最大值，气调贮藏组对CX活性有一定的抑制作用，并且随着贮藏时间的延长，2组CX活性相差越大。这说明贮藏时间越久，气调贮藏抑制效果越明显。

2.3气调贮藏对黄桃褐变相关酶活性的影响

2.3.1气调贮藏对黄桃多酚氧化酶（PPO）活性的影响。多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化产生醌，是引起果实褐变的关键酶。多酚氧化酶在黄桃果实中含量相当高，能引起黄桃变质和腐烂0，2种贮藏方式对多酚氧化酶活性的影响如图6所示。总体上，黄桃随着贮藏时间的延长，活性在贮藏前期逐渐降低，在第7天达到最低值，随后呈上升趋势一直到贮藏末期。气调贮藏组黄桃的多酚氧化酶活性较对照组黄桃的低。这说明气调贮藏处理可以抑制多酚氧化酶的活性，有效延缓果实衰老，延长了果实贮藏期。

2.3.2气调贮藏对黄桃过氧化物酶（POD）活性的影响。过氧化物酶可催化过氧化氢、氧化酚类和胺类化合物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用，其活性变化可作为果蔬成熟和衰老的标志。过氧化物酶（POD）是一种含铜蛋白质，POD也可以催化酚类物质发生褐变。POD一方面作为膜保护酶，清除组织中H2O2，可减轻H2O2对膜脂的伤害;另一方面可利用H2O2释放的O2氧化酚类物质，再经过一系列反应，最后导致果实褐变的发生叫。由图7可以看出，2组黄桃贮藏前期，过氧化物酶活性逐渐降低，贮藏第7天达到最低值，随后逐渐升高。随着贮藏时间的延长，黄桃产生的自由基越来越多，从而诱导了POD活性增加。但气调贮藏的黄桃POD活性明显低于对照组，说明气调贮藏可以有效抑制POD的活性。

2.4气调贮藏对黄桃丙二醛（MDA）含量的影响

植物在逆境或衰老条件下，会发生膜脂的过氧化过程。MDA是膜脂过氧化产物之一，其浓度表示脂质过氧化强度和膜系统伤害程度，故为逆境生理指标。随着果实的成熟和在低温胁迫条件下，果实MDA含量逐渐升高21。气调贮藏对贮藏期间黄桃果实的MDA含量有一定的影响作用。由图8可看出，在贮藏条件下，2组黄桃随着贮藏时间的延长，果实MDA含量呈上升趋势，这是果实后熟过程的一个反映。随着贮藏时间的延长，2个处理组果实的MDA含量差异越来越大。气调贮藏对黄桃果实的MDA含量有一定的影响作用，气调贮藏的黄桃MDA含量较对照组含量低，说明气调贮藏能抑制贮藏期间黄桃MDA含量的提高，降低脂质过氧化强度，减少细胞膜系统伤害程度，使黄桃果实腐烂程度降低。

3结论与讨论

通过比较黄桃气调贮藏组和对照组的乙醇脱氢酶、酰基转移酶和脂氧合酶的活性，结果表明，气调贮藏能延缓乙醇脱氢酶活性的降低，抑制酰基转移酶的快速下降，减少脂氧合酶活性的降低。这3种酶活性的大小直接影响黄桃风味物质（LOX途径）的多少。在气调藏后期，黄桃能在一定程度上维持果实一定的风味，与这3种酶保持相当活力密切相关。通过比较气调贮藏组和对照组的多聚半乳糖醛酸酶和内切一β-1，4-葡聚糖酶的活性及MDA含量，可以看出，气调贮藏能减少PG活性的上升，抑制内切一β-1，4-葡聚糖酶活性的作用，减少果实MDA含量的快速上升。因此，气调贮藏对降低细胞的氧化作用及膜脂过氧化作用.维持细胞壁及膜的完整性、减缓膜结构的氧化作用、维持黄桃果实较高的硬度有一定效果。通过比较黄桃气调贮藏组和对照组的多酚氧化酶和过氧化物酶的活性，结果表明，气调贴藏能抑制多酚氧化酶和过氧化物酶活性的增加。酶促褐变是由于植物组织内的酚类物质在多酚氧化酶的作用下，邻位的酚氧化为醌，醌很快聚合成为褐色素而引起组织褐变。随着贮藏时间的延长，黄桃发生衰老等因素刺激活性氧增加，从而引起果实褐变3）。因此，气调贮藏能延缓多酚氧化酶和过氧化物酶的活性，延缓黄桃的衰老与褐变。

综上所述，气调贮藏能有效减少黄桃果实中的乙醇脱氢酶酰基转移酶和脂氧合酶活性的降低，抑制多聚半乳糖醛酸酶和内切一β-1，4-葡聚糖酶活性的上升，减少果实MDA含量的快速上升，减少多酚氧化酶和过氧化物酶活性的增加。因此，气调贮藏能维持其细胞的正常代谢，减少风味劣变的发生;同时可减缓黄桃软化速度，延缓了果实衰老和褐变，从而延长黄桃的贮藏期。

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