郑文杰　潘清青　童旭峰　潘丽芹

摘要采用不同浓度的Zn2+.Cu2+溶液处理白三叶种子，研究Zn2+、Cu2*对白三叶种子萌发及幼苗生长的影响，旨在为白三叶在Zn2+.Cu2+污染土壤中的种植适宜性提供参考。结果表明，当Zn2*浓度达到125mg/L、Cu2+浓度为60mg/L及以上时，白三叶种子的发芽率、发芽势均受到显著抑制，对发芽指数无明显影响，但却显著影响种子的活力指数，并显著抑制了幼苗胚根、胚芽以及生物量的增加，且浓度越高抑制作用越明显，对胚根的抑制作用明显强于胚芽;白三叶种子萌发和幼苗生长对Zn2+的耐受力大于Cu2+，不适宜在Zn2+浓度达125mg/L及以上的土壤中种植，而Cu2+污染的限制浓度为60mg/L、且250mg/L可认为是白三叶幼苗的致死剂量。

关键词 Zn2*;Cu2*;白三叶;胁迫;重金属离子

中图分类号 S762.2

文献标识码 A

文章编号 1007-5739（2019）07-0121-02

近年来，土壤重金属污染问题日益严重”。在我国，有1/6左右叫的耕地土壤受到重金属污染。重金属污染因对土壤的影响持续时间长、污染隐蔽以及不可逆性等原因而被人们广为关注。土壤中的重金属严重影响着植物的生长、发育、生理生化及矿质营养代谢过程B-61。Zn2+、Cu2+是植物体内不可或缺的微量元素之-7-8，而过量的Zn2+、Cu2会对植物生长产生危害，同时，经食物链富集于人体当中，会扰乱人体的正常机能和新陈代谢，甚至导致重金属中毒。白三叶（Trifolium repens）又名白车轴草，为多年生草本植物，其植株低矮抗逆性强、适应性广、再生性好，可有效防止水土流失，被广泛应用于城市绿化和水土保持。目前，对白三叶的研究多为从生理生态角度研究其对环境胁迫的耐性19-10]，而白三叶对重金属胁迫的响应则研究甚少。因此，重金属胁迫对白三叶生理生态的影响具有一定的研究价值。本研究以白三叶种子为研究材料，模拟不同浓度的Zn2+Cu2+胁迫，探讨Zn2+、Cu2对白三叶种子萌发的影响，旨在为白三叶在锌、铜污染土壤中的种植适宜性提供参考，并进一步探讨白三叶作为土壤重金属污染修复植物的可能性。

1材料与方法

1.1材料与试剂

白三叶种子网购于江苏花草种业公司。ZnSO4.7H2O、无水硫酸铜购自杭州宝成生物技术有限公司，含量≥99.5%，分析纯试剂AR级。

1.2试验方法

试验于2016年12月在台州科技职业学院园艺植物分子生物学实验室内进行，将重金属Zn2+Cu2+浓度分别设为30、60、125、250mg/L，试验设9个处理，分别为Zn2+30mg/L（A1）、60mg/L（A2）、125mg/L（A3）、250mg/L（A4）胁迫和Cu2+30mg/L（B.）.60mg/L（B2）、125mg/L（B）、250mg/L（B4）胁迫以及蒸馏水培养（CK）。

取大小均匀、健康饱满的白三叶种子，用0.1%HgCl2浸泡5min，再用蒸馏水反复冲洗干净。培养皿灭菌后在底部铺上直径为11em的定性滤纸2层，分别滴加等量不同浓度的Zn2+、Cu2+溶液浸润滤纸，在培养皿内均匀放入50粒种子。每个处理3次重复。将培养皿置于温度为25C相对湿度为75%的人工气候箱中，设定光照时长8h、光照强度为1150lx。观察种子的发芽情况及幼苗的生长状况，并做好记录。

1.3测定指标

1.3.1种子萌发测定指标。按照《农作物种子检验规程发芽试验》（GB/T3543.4-1995），在处理第3天统计白三叶种子发芽势，第7天测定发芽率。从发芽次日开始，每天统计发芽种子数（以胚根突出种皮作为发芽标准），并始终保持滤纸湿润，连续测定7d，用于计算种子发芽的相关指标。

发芽势（%）=（7d内种子的发芽数（种子数）x100%;发芽率（GP）（%）=（种子发芽数种子数）x100%;发芽指数（GI）=2GT/Dt;

活力指数（VI）=GlxS。

式中，GT为种子在t日的发芽数;Dt为发芽天数;S为发芽后第7天幼苗的长度。

1.3.2幼苗形态指标。胁迫12d时，测定幼苗生长指标。株高、茎粗采用常规测量法，用卷尺测量株高，用游标卡尺测量茎粗。生物量干重测定方法为用滤纸吸干幼苗表面的水分，每处理随机选取生长较为一致的幼苗50株，分地上部分、地下部分分别称鲜重。生物量干重测定方法为将植株置于干燥箱中105C条件下烘15min，再于80C下烘至恒重后称重"。

根冠比=根干重/地上部干重;

平均胚芽长=选取的50颗种子胚芽长的累加/50;平均胚根长=选取的50颗种子胚根长的累加/50。1.4数据处理

本试验采用Excel2010进行数据整理，用SPSS13.0统计软件进行数据分析.与统计，应用LSD法对数据进行方差分析。

2结果与分析

2.1对白三叶种子发芽率与发芽势的影响

本研究中，不同浓度的Zn2+、Cu2+对白三叶种子的萌发有不同程度的影响（表1）。当Zn2+浓度为3060mg/L时，种子的发芽率分别为81.4%和82.3%，稍低于对照（CK）的86.7%;而當浓度高达125、250mg/L时，种子的萌发率仅分别为72.3%和70.2%，显著低于对照（P<0.05），说明较高浓度的Zn2对种子的萌发起到了一定的抑制作用。Cu2+对白三叶种子萌发的影响稍有不同。当Cu2浓度为30mg/L时，种子发芽率为82.2%，与对照差别不大;当Cu2+浓度达到60mg/L及以上时，种子发芽率则显著低于对照（P<0.05），表现出了明显的抑制作用。Zn2和Cu2+胁迫对发芽势的影响效果与发芽率基本相似。

2.2对白三叶种子发芽指数和活力指数的影响

不同浓度Zn2+、Cu2胁迫对白三叶种子发芽指数和活力指数的影响如表1所示。从表中可以看出，种子发芽指数受重金属离子胁迫的影响较小，而Zn2+、Cu2+胁迫对种子活力指数的影响较大，均显著低于对照（P<0.05）。说明这2种重金属离子对于种子的萌发影响不大，而对于幼苗的生长则具有较大影响，显著抑制了植株的伸长生长。

2.3对白三叶幼苗胚芽、胚根生长的影响

不同浓度Zn2+、Cu2+胁迫对白三叶幼苗胚芽胚根生长的影响如表1所示。从表中可以看出，Zn2+胁迫对白三叶幼苗胚根的生长有显著的抑制作用（P<0.05）。处理A1、A2的平均胚根长分别为15.6、13.2mm，远低于对照（30.7mm）;处理A3、A4的幼苗平均胚根长仅为5.8、5.2mm，可见随着Zn2+浓度增大，根的生长显著受到抑制。Zn2+胁迫对幼苗胚芽的生长亦具有抑制作用，处理A1、A2、A3、A4的幼苗平均胚芽长依次为10.4、8.7、7.1、6.4mm，均低于对照（11.7mm）;当浓度达到125mg/L及以上时，胚芽生长显著受到抑制。

Cu2+胁迫对白三叶胚根胚芽生长具有更明显的抑制作用，处理B，、B2、B3、B4的平均胚根长分别为6.8、2.7、1.40mm，平均胚芽长分别为5.6、3.5、1.1、0.2mm，均显著低于对照;尤其当浓度达到250mg/L时，幼苗停止生长，且大多已失水黄化或枯死。

2.4对白三叶幼苗生物量及根冠比的影响

不同浓度Zn2+、Cu2+胁迫处理后12d后，测定50株幼苗的鲜重与千重，统计分析不同浓度对白三叶幼苗生物量及根冠比的影响，结果如表2所示。由表可知，与对照相比，不同浓度的Zn2脅迫对白三叶幼苗的鲜重、干重均具有显著的抑制作用（P<0.05），其中处理A4影响最大。Zn2+胁迫对根冠比的影响稍有不同，处理AA2与对照相差不大;而处理A3、A4的根冠比仅为0.11、0.09，显著低于对照（0.25）。说明随着Zn2+浓度的增加，对幼苗根系的抑制作用更加显著.Cu2+胁迫对白三叶幼苗生长的抑制作用更加明显，尤其当浓度达到250mg/L时，幼苗根系不再生长，导致大多数植株枯死，无法进行生物量及根冠比的统计与计算。本试验中，各处理根冠比均小于1，随着离子浓度的增大，根冠比越来越小，表明重金属离子浓度越高，对地下部根的抑制作用越大，而对地上部芽的抑制作用明显小于根。

3结论与讨论

种子发芽和幼苗生长受重金属的影响较大，因而可以作为检测土壤重金属污染的重要指标四。本研究结果表明，不同浓度的Zn2+、Cu7胁迫对白三叶种子萌发及幼苗生长均具有一定程度的影响，随着浓度的增加，种子萌发及幼苗生长受到的抑制作，用增强。当Zn2*浓度为30、60mg/L时，对种子发芽率、发芽势及发芽指数等指标影响不大;而当Zn2*浓度达到125mg/L及以上时，则对白三叶的种子发芽和幼苗生长起到了显著的抑制作用。白三叶种子萌发与幼苗生长对Cu2+更加敏感，Cu2胁迫抑制作用更加显著。在试验5d之后，60mg/L及以上浓度Cu2+处理的幼苗根系不再伸长，地上部分均出现不同程度的黄化;试验7d后，高浓度Cu2+处理的幼苗已大多枯死。这是因为Cu2*抑制了幼苗根系的生长，从而影响整个植株的生长。因此，本研究认为，白三叶对Zn2+的耐受力大于Cu2+，不适宜在Zn2+浓度为125mg/L及以上的土壤中种植;而Cu2+污染的限制浓度为60mg/L，且250mg/L可认为是白三叶幼苗的致死剂量。

用不同浓度的Zn2+、Cu2+处理白三叶种子时，均不同程度地抑制了种子的发芽率和发芽势，这与张春荣等31、张虹等叫低浓度促进、高浓度抑制的研究结果不一致，可能是由于不同植物对重金属污染的敏感性存在差异。另外，这2种重金属胁迫对种子的发芽指数无显著影响，而对种子的活力指数影响非常显著，不同浓度处理间差异较大。Zn2+、Cu2*处理对胚根、胚芽的生长和生物量的增加均具有显著的抑制作用，对幼苗胚根的毒害作用明显强于对胚芽的毒害作用。这可能是因为根在种子萌发时最先突破种皮吸水，根系中重金属累积量较大，且受胁迫时间也比胚芽长5），因而更易遭到毒害，停止生长。根系停止对水分及矿质营养的吸收，进而导致地上部分失绿黄化枯死。

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