结直肠癌是常见的消化道肿瘤，近年来其发病率呈现上升趋势[1]。大量研究表明，结直肠癌的发生发展是一个涉及基因表达过度、抑癌基因失活、癌基因激活的多步骤、多基因参与的复杂过程[2]。目前基因的靶向治疗已成为预防结直肠癌发生及降低病死率的一个重要手段。CST1基因定位于20p11.21染色体，编码一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂Cystatin SN，属于半胱氨酸蛋白酶抑制剂超家族。近年来大量研究表明，过度表达的CST1在恶性肿瘤细胞的增殖、转移及浸润等方面发挥关键作用。如CST1表达上调的膀胱移行细胞癌患者的复发率较高[3]，胃癌中CST1基因异常高表达，RNA干扰其表达后可降低细胞增殖[4]。CST1基因在结直肠癌中的研究较少，有研究表明半胱氨酸蛋白酶抑制剂Cystatin C与Cystatin SN一样，也属于半胱氨酸蛋白酶抑制剂超家族，在结肠腺癌中的表达高于正常对照组[5]，但CST1表达对结直肠癌细胞生物学特性及机制尚未明确。信号转导和转录激活因子3(STAT3)是细胞内重要的信号途径，与包括结直肠癌在内的多种肿瘤的发生、发展密切相关[6]。本研究检测了不同结直肠癌细胞中的CST1表达，采用RNA干扰抑制其表达，观察CST1表达被抑制后的细胞活力及侵袭能力，并进一步研究其对STAT3信号通路的影响，以期为结直肠癌的诊疗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 细胞及主要试剂和仪器

正常结肠NCM460细胞及人结直肠癌SW480、HCT116、Caco2和HT29细胞均购自美国模式培养物集存库(ATCC)；DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、MTT溶液、DMSO均购自美国Sigma公司；Transwell侵袭小室购自美国Corning公司； STAT3、磷酸化信号转导和转录激活因子3(p-STAT3)、增殖细胞核抗原(PCNA)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和MMP-9及甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体均购自美国CST公司；酶标仪购自美国Biotek公司。

1.2 细胞培养

NCM460、SW480、HCT116、Caco2和HT29细胞在37 ℃、5%体积分数CO2培养箱中用DMEM培养基培养，细胞生长达80%融合密度时，使用胰酶消化后传代。实验取生长至对数期的细胞。

1.3 转染

根据siRNA的设计原则，设计针对CST1的特异性siRNA(si-CST1组)，同时设计阴性对照siRNA(NC组)，且序列经BLAST同源比较分析后显示与其他人类基因序列无同源性，由上海吉玛制药技术有限公司合成。转染前24 h，以1×105个/孔接种生长至对数期的HCT116细胞于6孔板，细胞80%～90%汇合时，将已制备好的siRNA-Lip2000混合物加入6孔板，空白对照组仅加入脂质体，转染参照LipofectamineTM2000说明，培养箱内孵育转染好的细胞5～6 h，更换培养基(含血清及抗生素)后继续培养，48 h后收集细胞，用于后续实验研究。

1.4 细胞活力检测

HCT116细胞以5×103个/孔接种于96孔板，常规培养24 h后，将CST1的特异性siRNA及阴性对照siRNA转染细胞，并设置空白对照组，收集转染48 h的3组细胞，加入MTT溶液(5 mg/mL)，每孔20 μL，于37 ℃条件下孵育4 h，吸弃孔内溶液，加入150 μL的DMSO溶液于每孔中，震摇混匀15 min，490 nm波长，酶标仪测定各个孔的吸光度值(A值)。实验重复3次。

1.5 细胞侵袭能力检测

实验前在Transwell小室中间的聚碳酸酯滤膜上铺上已预先稀释好的Matrigel胶。将生长至对数期的HCT116细胞参照1.3分组制备成不含血清的单细胞悬液100 μL(约1×105个细胞)，接种于Transwell小室的上室，Transwell小室下室的每孔中加入含血清的培养基500 μL，于37 ℃、5%体积分数CO2培养箱中孵育24 h，取出小室，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%的结晶紫染色10 min，PBS洗涤后将小室转移至24孔板，随机选择6～8个视野，倒置显微镜观察穿膜细胞数，取均值。实验重复3次。

1.6 Western blotting检测蛋白表达

RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，取等量蛋白上样，依次经10%SDS-PAGE、转膜、封闭后，加入均按照1∶500稀释的STAT3、p-STAT3、PCNA、MMP-2、MMP-9及内参GAPDH抗体，洗膜，加HRP标记的二抗(1∶2 000稀释)，室温孵育1 h，洗膜，ECL显色，显影，定影，应用gel pro 4.0软件分析各蛋白条带灰度值，目的蛋白与GAPDH蛋白的灰度值比值为各蛋白相对表达量。实验重复3次。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 5种细胞中CST1蛋白的表达

正常结肠NCM460细胞和人结直肠癌SW480、HCT116、Caco2和HT29细胞中CST1蛋白的表达分别为0.068±0.009、0.254±0.028、0.478±0.050、0.268±0.030、0.339±0.035。4种人结直肠癌细胞中CST1蛋白的表达均显著高于正常结肠NCM460细胞，差异均有统计学意义(P均<0.05)。见图1。

图1 5种细胞中CST1蛋白表达的比较

2.2 CST1 siRNA转染的效果

空白对照组、NC组和si-CST1组HCT116细胞中CST1蛋白的表达分别为0.526±0.054、0.515±0.051、0.096±0.012。si-CST1组HCT116细胞的CST1蛋白表达显著低于空白对照组(P<0.05)，而NC组HCT116细胞的CST1蛋白表达与空白对照组的差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

图2 3组HCT116细胞中CST1蛋白表达的比较

2.3 CST1 siRNA对HCT116细胞活力和侵袭能力的影响

各组细胞活力和侵袭能力检测结果显示，与NC组比较，si-CST1组细胞活力显著降低，细胞侵袭能力显著降低，差异均具有统计学意义(P均<0.05)。见表1、图3。

表1 3组HCT116细胞的活力和侵袭能力比较()

注：与NC组比较，aP<0.05

图3 3组HCT116细胞的侵袭能力比较 A 空白对照组 B NC组 C si-CST1组

2.4 CST1 siRNA对3组HCT116细胞中STAT3信号通路的影响

Western blotting检测STAT3、p-STAT3及STAT3信号通路下游与增殖、侵袭相关的PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白的表达，结果显示，与NC组相比，si-CST1组HCT116细胞中p-STAT3、PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白的表达均显著降低(P均<0.05)。3组HCT116细胞中STAT3蛋白表达的差异无统计学意义(P>0.05)。见表2、图4。

表2 3组HCT116细胞中STAT3、p-STAT3、PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白表达的比较

注：与NC组比较，aP<0.05

图43组HCT116细胞中STAT3、p-STAT3、PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白表达的比较

3 讨论

恶性肿瘤的发生、发展与基因表达异常、突变等有密切关系，目前已明确了肿瘤发生的部分机制，但恶性肿瘤的侵袭转移及向周围浸润仍是肿瘤治疗的一个难题。有研究表明，CST1基因异常表达与肿瘤发生、发展密切相关。CST1表达对胰腺癌增殖起促进作用，可作为胰腺癌早期检测的潜在生物学标志物[7]；CST1的高表达与乳腺癌患者生存期呈负相关，可促进乳腺癌细胞的增殖、克隆形成能力及转移[8]。CST1对结直肠癌的影响尚未明确，因此本研究首先检测了不同结直肠癌细胞中的CST1表达，发现结直肠癌细胞中CST1表达均明显高于正常结肠细胞，结直肠癌HCT116细胞中CST1表达最高，故选择其作为研究对象。RNA干扰(RNAi)技术是一种能在转录后阻断特异性基因表达的新技术，具有高效性和特异性，与其他基因表达阻断技术相比更具优势，目前已广泛应用于肿瘤治疗、基因功能研究等方面[9-10]。本研究将设计合成的CST1的特异性siRNA转染HCT116细胞，发现CST1表达受到抑制后结肠癌细胞的活力及侵袭能力均明显降低，提示CST1表达受抑可抑制结直肠癌细胞的生长。

STAT3是STAT家族成员，其与肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移、血管形成、分化等密切相关。研究表明，在结直肠癌、肺癌等多种人类肿瘤中均存在STAT3信号的异常活化，其活化可加速肿瘤进展，因此被称为癌基因[11-12]。另有研究显示，抑制结直肠癌细胞的STAT3信号可抑制肿瘤细胞的生长[13]。STAT3并不直接引起肿瘤发生，而是通过调节某些与肿瘤生长相关的因子的表达从而影响肿瘤的发生、发展。PCNA是一种仅出现在增殖状态细胞核内的酸性蛋白质，是合成DNA不可或缺的因子，在包括结直肠癌在内的多种肿瘤中表达升高，其表达水平可反映细胞的增殖状态[14]。高侵袭和迁移能力是恶性肿瘤细胞的主要特征，而细胞外基质是抑制肿瘤细胞转移的主要屏障。MMP-2和MMP-9是MMP家族的主要蛋白水解酶，参与细胞外基质的降解，其异常表达可破坏细胞外基质平衡，促进肿瘤的侵袭和转移[15]。研究表明，结直肠癌、肺癌等多种肿瘤中均可检测到MMP-2和MMP-9表达水平升高，而抑制MMP-2和MMP-9表达可减弱结直肠癌细胞的侵袭迁移能力[16-17]。本研究结果显示，CST1基因表达受抑可降低p-STAT3、PCNA、MMP-2和MMP-9的表达，提示CST1基因对结直肠癌细胞生长的影响与下调STAT3信号通路有关。

综上所述，RNA干扰 CST1基因表达可抑制结直肠癌细胞的增殖和侵袭，其机制可能与下调STAT3信号通路有关。本研究结果提示CST1可能是结直肠癌诊疗的一个有效靶点，但这需要更多的研究证实。