慢性心力衰竭(CHF)以呼吸困难、疲乏、双下肢水肿等为主要临床表现的各种心脏疾病进展的终末期综合征[1]。近年来，我国CHF的发病呈现不断上升趋势，截至目前，已有CHF病人400万人左右，2015年中国心血管病报告称，35～74岁人群CHF患病率为0.9%，其中男性为0.7%，女性稍高为1.0%[2]，死亡率也处于较高水平，4年死亡率高达50%[3]，严重危及病人生命。延缓病情进展、提高病人生活质量、降低死亡率是CHF治疗的目的。如今，临床上对于CHF的治疗方法较多，目前以血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(ARB)、醛固酮受体拮抗剂、β受体阻滞剂等为主，这些药物对于临床症状改善有一定的效果，但在控制疾病进展方面疗效不理想，需要寻找更为有效的方法来治疗。有研究认为，CHF的主要病理基础为心肌细胞凋亡、心肌纤维化[4]，可以视为治疗CHF的重要靶点。近年来有研究显示，中药在抑制心肌细胞凋亡、逆转心肌纤维化等方面均具有独特疗效，并因此受到越来越多的关注[5]。本研究探讨芪参益气汤对阿霉素致CHF大鼠心功能及微小核糖核酸133a (miR133a)表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象 90只6～7周龄清洁级健康雄性Wistar大鼠，体重200～220(212.73±8.12)g，动物许可证号：SCXK(京)2016-0011，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。将大鼠4只/笼置于饲养室内进行适应性饲养，室内温度20～23 ℃，湿度40%～60%，换气频率为8～15次/h，空气经滤过系统过滤后清洁度10 000级，噪声在50 dB以下，以标准饲料和无菌过滤水为主，大鼠自由摄入水，每日消毒，更换垫料，饲养时间为5 d。

1.1.2 主要药品与试剂 芪参益气汤组方：人参、黄芪、茯苓、淫羊藿各20 g，丹参、白术、葶苈子各15 g，仙鹤草30 g，桂枝、甘草各10 g。药材购于安国中盛药材有限公司，由煎药室分别制成浓度为0.8 g/mL、1.6 g/mL、3.2 g/mL的水煎剂备用。阿霉素[注射用盐酸多柔比星，规格：每支10 mg，批号：20170102，购自辉瑞制药(无锡)有限公司]用0.9%氯化钠溶液稀释为浓度2 mg/mL的阿霉素溶液使用，现用现配；卡托普利片(规格：每片12.5 mg，批号：20170115，购自江苏康缘药业股份有限公司)研碎并溶于0.9%氯化钠溶液制成浓度为0.25 mg/mL的卡托普利溶液使用，现用现配。10%水合氯醛，购自长沙达尔锋生物科技有限公司；盐酸三(羟甲基)氨基甲烷(Tris-HCl)，购自北京孚博生物科技有限公司；末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP 缺口末端标记测定法(TUNEL法)细胞凋亡试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色剂，购自上海恒斐生物科技有限公司；蛋白裂解液(RIPA)，购自上海研谨生物科技有限公司；二奎啉甲酸法(BCA法)蛋白定量试剂盒，购自深圳子科生物科技有限公司；B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)蛋白多克隆抗体、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-9(Caspase-9)多克隆抗体、β-actin抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗，英国Abcam公司产品；超敏化学发光底物(ECL)试剂盒，购自武汉博士德生物工程有限公司；总RNA提取试剂盒(TRIzol法)、荧光定量®RNA逆转录试剂盒，北京百泰克生物技术有限公司。

1.1.3 主要仪器设备 Vevo®2100型小动物彩色多普勒超声影像系统，加拿大Visual Sonics公司产品；YS1000光学显微镜，日本OlyTM7实时荧光定量PCR系统，美国Thermo Fisher Scientific公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 造模及实验方法[6]适应性饲养后，按随机数字表法将所有大鼠分为对照组、模型组、西药组及中药低、中、高剂量组，各15只。模型组、西药组及中药低、中、高剂量组大鼠予以2 mg/mL的阿霉素溶液0.5 mL/kg尾静脉注射，对照组大鼠予以0.9%氯化钠溶液0.5 mL/kg尾静脉注射，每周注射1次。各组大鼠均注射6周。末次注射后3 d，检查各组大鼠心脏彩超，若射血分数(EF)不足60%即为成功建立CHF模型，造模失败或意外死亡的大鼠及时进行补充。成功建立CHF模型后，模型组、对照组分别给予0.9%氯化钠溶液10 mL/kg，灌胃给药，每日1次；西药组给予0.25 mg/mL卡托普利溶液10 mL/kg，灌胃给药，每日1次；中药低、中、高剂量组分别给予0.8 g/mL、1.6 g/mL、3.2 g/mL芪参益气汤10 mL/kg，灌胃给药，每日1次。各组大鼠均连续给药28 d。

1.2.2 大鼠心脏超声检测 分别于末次给药后2 d，腹腔注射10%水合氯醛300 mg/kg以麻醉大鼠，左侧胸口处备皮，采用Vevo®2100型小动物彩色多普勒超声影像系统测定大鼠左室舒张末期内径(LVEDD)、左室收缩末期内径(LVESD)、EF、左室短轴缩短率(FS)，连续测量3个心动周期，取平均值。

1.2.3 标本采集与处理[7]心脏超声检查结束后，开胸，用4 ℃生理盐水灌洗心脏，之后将心脏完整取出，洗去残血，滤纸吸干，取1/2左心室组织置于10%甲醛溶液内固定12 h，常规脱水、透明、石蜡包埋，用切片机制备5 μm石蜡切片；剩余1/2左心室组织采用液氮内速冻，之后置于-70 ℃冰箱内保存，用于蛋白质免疫印迹(Western Blot)及实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)实验检测。

1.2.4 TUNEL法检测心肌细胞凋亡[8]取1.2.3中制备的心肌组织石蜡切片，常规二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化，将切片置于20 μg/mL蛋白酶 K溶液(pH7.4)+ Tris-HCl溶液10 mL内进行细胞通透，室温反应30 min，磷酸盐缓冲溶液(PBS)漂洗3 min×2次；配置TUNEL反应混合液并滴加50 μL进行标记，加封口膜，37 ℃避光反应1 h，PBS冲洗3 min×3次；采用DAB显色剂显色，室温反应30 min，PBS冲洗3 min×3次；滴加苏木素溶液进行复染，1 min后自来水冲洗，常规脱水、透明、中性树胶封片。在光学显微镜下观察染色结果、拍照，每张切片选择5个不重复视野，采用Med6.0数码医学图像分析系统计数凋亡细胞数和总细胞数，细胞凋亡指数(AI)=凋亡细胞数/总细胞数×100%，计算每个视野内的心肌AI，之后取平均值。

1.2.5 Western Blot法检测大鼠心肌组织Bcl-2蛋白、Caspase-9蛋白表达水平[9]取出1.2.3中冻存的心肌组织，滴加RIPA蛋白裂解液，充分匀浆后，以3 000 r/min速度离心15 min，提取上清液；采用蛋白定量试剂盒检测总蛋白质含量，电泳仪每个泳道上样50 μg蛋白，通过SDS-PAGE凝胶电泳分离目的蛋白，电泳条件：浓缩胶80 V、时间30 min，分离胶120 V、时间1 h；采用半干法将分离后的蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜上，用5%牛血清白蛋白溶液摇床封闭3 h；洗膜，滴加1∶1 000稀释的Bcl-2抗体、Caspase-9抗体及1∶50稀释的β-actin(内参)，4 ℃过夜；滴加1∶2 000稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗，摇床孵育2 h；超敏ECL试剂盒显色，之后在暗室内用X光胶片显影、定影，采用Med6.0数码医学图像分析系统分析目的蛋白条带灰度值，计算心肌组织Bcl-2蛋白、Caspase-9蛋白相对表达水平。

1.2.6 Real-time PCR法检测大鼠心肌组织miR 133a、Bcl-2 mRNA及Caspase-9 mRNA表达水平[9]取出1.2.3中冻存的心肌组织，充分研磨匀浆，采用总RNA提取试剂盒(TRIzol法)提取总RNA，并计算总RNA浓度；取总RNA溶液，采用荧光定量®RNA逆转录试剂盒配制实时PCR反应体系，将为miR 133a、Bcl-2 mRNA、Caspase-9 mRNA、内参β-actin逆转录为cDNA，采用Primer 5.0软件为miR 133a、Bcl-2 mRNA、Caspase-9 mRNA、内参β-actin设计相应的引物序列，采用实时荧光定量PCR系统进行扩增，并获得溶解曲线，从而确定各产物浓度，获得相应Ct值。采用2-ΔΔCt方法计算miR 133a、Bcl-2 mRNA、Caspase-9 mRNA相对表达量，ΔΔCt=实验组(目的基因Ct值-内参β-actin Ct值)-对照组(目的基因Ct值-内参β-actin Ct值)。

2 结 果

2.1 各组大鼠LVEDD、LVESD、EF、FS比较 与对照组比较，其他各组大鼠LVEDD、LVESD水平升高，EF、FS水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，与模型组比较，中药低、中、高剂量组和西药组大鼠LVEDD、LVESD水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，中药低、中、高剂量组和西药组大鼠EF、FS水平较高，其中中药低剂量组<中药中剂量组<中药高剂量组和西药组，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠LVEDD、LVESD、EF、FS比较(±s)

与对照组比较，1)P<0.05；与模型组比较，2)P<0.05；与中药低剂量组比较，3)P<0.05；与中药中剂量组比较，4)P<0.05

2.2 TUNEL法检测各组大鼠心肌AI结果比较 凋亡阳性细胞的细胞核、胞浆、胞膜上存在被染成棕黄色或黄色的颗粒，其余各组心肌组织存在不同程度的细胞凋亡(见图1)。定量结果显示，与对照组比较，其余各组大鼠心肌AI升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，中药低、中、高剂量组和西药组大鼠心肌AI较低，其中中药低剂量组>中药中剂量组>中药高剂量组、西药组，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠心肌AI比较(±s)

与对照组比较，1)P<0.05；与模型组比较，2)P<0.05；与中药低剂量组比较，3)P<0.05；与中药中剂量组比较，4)P<0.05

A为对照组；B为模型组；C为中药低剂量组；D为中药中剂量组；E为中药高剂量组；F为西药组

图1 TUNEL法检测各组大鼠心肌细胞凋亡结果(×200)

2.3 各组大鼠心肌组织Bcl-2蛋白、Caspase-9蛋白表达水平比较 与对照组比较，其他各组大鼠心肌组织Caspase-9蛋白水平升高，Bcl-2蛋白水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，中药低、中、高剂量组和西药组大鼠心肌组织Caspase-9蛋白表达水平较低，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，中药低、中、高剂量组和西药组大鼠心肌组织Bcl-2蛋白表达水平较高，其中中药低剂量组<中药中剂量组<中药高剂量组、西药组，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表3、图2。

表3 各组大鼠心肌组织Bcl-2蛋白、Caspase-9蛋白表达水平比较(±s)

与对照组比较，1)P<0.05；与模型组比较，2)P<0.05；与中药低剂量组比较，3)P<0.05；与中药中剂量组比较，4)P<0.05

A为对照组；B为模型组；C为中药低剂量组；D为中药中剂量组；E为中药高剂量组；F为西药组

图2 WesternBlot法检测各组大鼠心肌组织Bcl-2蛋白、Caspase-9蛋白表达

2.4 各组大鼠心肌组织miR133a、Bcl-2 mRNA、Caspase-9 mRNA表达水平比较 与对照组比较，各组大鼠心肌组织Caspase-9 mRNA表达水平升高，miR 133a、Bcl-2 mRNA表达水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，中药低、中、高剂量组和西药组大鼠心肌组织Caspase-9 mRNA表达水平降低，其中中药低剂量组>中药中剂量组>中药高剂量组和西药组，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，中药低、中、高剂量组和西药组大鼠心肌组织miR133a、Bcl-2 mRNA表达水平较高，其中中药低剂量组<中药中剂量组<中药高剂量组和西药组，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表4。

表4 各组大鼠心肌组织miR133a、Bcl-2 mRNA、Caspase-9 mRNA表达水平比较(±s)

与对照组比较，1)P<0.05；与模型组比较，2)P<0.05；与中药低剂量组比较，3)P<0.05；与中药中剂量组比较，4)P<

0.05

3 讨 论

CHF是导致心血管疾病病人死亡的主要原因之一，给病人、家庭及社会造成了沉重的负担，是目前亟待解决的公共健康问题。CHF的发病机制十分复杂，涉及血流动力学改变、神经内分泌系统激活、心室重塑等多个方面。目前普遍认为，心肌重构是CHF的关键病理基础[10]，而心肌细胞凋亡是心肌重构的重要方面，其一，可造成心肌细胞缺失，心室功能受损而泵血无力，出现CHF；其二，代偿性导致左心室肥大、肾素-血管紧张素系统活性增强等；其三，还参与心肌细胞胶原网架、血管床等的变化过程，诱发心室重构。张旭等[11]研究表明，抑制心肌细胞凋亡对于延缓心室重构、改善心功能等具有重要意义。因此，研究干预、阻断心肌细胞凋亡的新药是防治CHF的新方向。中医药资源丰富，具有通过多靶点、多途径、多环节发挥作用的特点，在抗心肌细胞凋亡方面也有确切作用[11]，故可称为CHF新药研究的主要来源[12]。

在中医学理论中没有CHF这一病名，一般将该病归于“心悸”“喘证”“水肿”“胸痹”等范畴。该病病位在心，为本虚标实之证，本虚指心气心阳亏虚，标实指血瘀水停，故治疗上以益气温阳、化瘀逐水为主[12]。本研究采用阿霉素尾静脉注射的方法建立CHF模型，造模后模型组LVEDD、LVESD水平高于对照组，EF、FS水平低于对照组，可见心脏功能明显下降，表明成功建立了CHF模型。之后采用不同剂量的芪参益气汤进行干预，芪参益气汤中人参、黄芪共为君药，大补元气、温阳利水，臣药淫羊藿温补肾阳，桂枝温通经脉、助阳化气，助君药益气温阳，佐药白术燥湿利水，茯苓渗湿利水，葶苈子利水消肿，仙鹤草益气强心，丹参活血祛瘀，发挥活血化瘀、利水逐饮之效，甘草调和诸药，全方共奏益气温阳、活血利水之效。有研究结果显示，与模型组比较，中药低、中、高剂量组和西药组大鼠LVEDD、LVESD水平较低，EF、FS水平较高，EF是用来反映心脏泵血功能的常用指标，FS则与EF有相同的意义，LVEDD反映心室舒张末期容积，其水平与EF呈负相关关系，LVESD显示心室收缩末期容积，数值越大，提示泵血功能越差。本研究结果表明，芪参益气汤能有效改善心脏功能，减轻CHF病情，而且作用强弱与药物剂量有关，剂量越大，治疗效果越明显。

TUNEL法检测结果显示，与模型组比较，中药低、中、高剂量组和西药组大鼠心肌AI较低，其中中药低剂量组>中药中剂量组>中药高剂量组和西药组，表明芪参益气汤对于CHF大鼠的心肌细胞凋亡有抑制作用。邓建南等[13]研究认为，人参中的人参皂苷Rb1成分能够通过调节凋亡相关蛋白和mRNA表达水平，来抑制心肌细胞凋亡，对抗心力衰竭；沈丽娟等[14]研究表明，黄芪甲苷可以通过降低氧自由基水平，促进Bcl-2表达同时抑制Bax表达来发挥作用，抑制阿霉素诱导的大鼠心肌细胞凋亡；李富饶等[15]研究认为，淫羊藿总黄酮也能抑制凋亡相关蛋白Caspse-9、Caspase-3等表达，还能减轻心肌细胞DNA片段化，减少心肌细胞凋亡，改善CHF大鼠心功能。上述活性成分均可能存在于芪参益气汤中，证实了芪参益气汤抑制心肌细胞凋亡的功效，这可能也是芪参益气汤改善CHF模型大鼠心脏功能的主要机制。

微小RNA是由21～25个核苷酸组成的不编码蛋白质的小分子RNA，参与多种重要的生物进程，miR 133a即是其中一员。miR133a主要分布于心肌组织，属于心脏特异性微小RNA，与CHF发生发展关系密切，上调miR133a有助于保护CHF[16]。有研究认为，miR133a具有抗凋亡效应，能够降低心肌细胞凋亡水平。Caspase-9和Bcl-2属于miR133a调节凋亡的效应蛋白，Caspase-9属于细胞凋亡的起始者，可以通过切割特定蛋白造成细胞凋亡，而miR133a对Caspase-9表达有抑制作用[17]；Bcl-2则属于细胞存活促进因子，其可以抑制细胞色素C释放，减少细胞凋亡，上调Bcl-2有助于保护心肌细胞。本研究结果显示，与模型组比较，中药低、中、高剂量组和西药组大鼠心肌组织miR133a、Bcl-2 mRNA及Bcl-2蛋白表达水平较高，Caspase-9 mRNA及Caspase-9蛋白表达水平较低，表明芪参益气汤有促进miR133a表达上调的作用，并因此引起Caspase-9表达下调和Bcl-2表达上调，从而发挥抗心肌细胞凋亡的作用。

综上所述，芪参益气汤能明显改善CHF大鼠的心功能，而且剂量越高效果越好，其作用可能与促进miR133a表达，调节miR133a下游Bcl-2、Caspase-9蛋白表达水平，抑制心肌细胞凋亡有关。