陶 李 杜 明 王昱斌 李光迪

(兰州大学第二医院检验中心,兰州730000)

类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性炎症性、自身免疫性疾病，目前病因不明。临床多表现为手、足小关节的对称性、侵袭性炎症。免疫细胞的激活、炎症介质的浸润在RA的发生发展中扮演至关重要的角色[1，2]。

钙卫蛋白是由S100A8和S100A9两种钙结合蛋白组成的异源二聚体。作为一种炎症性蛋白质，其血清水平会在组织出现损伤或炎症时升高[3，4]。有研究指出钙卫蛋白在RA患者滑膜及滑液中高表达，提示其可能参与RA的致病过程[5，6]。因此，本研究通过检测RA组患者与骨关节炎(Osteoarth-ritis,OA)组患者以及正常对照组血清钙卫蛋白水平，从而分析血清钙卫蛋白对于RA的诊断价值以及其与RA临床和实验室指标之间的关系。

1 资料与方法

1.1 资料 选取2017年10月至2018年5月在兰州大学第二医院风湿免疫科住院的并且诊断明确的60例RA患者和48例OA患者，RA诊断标准符合2010版美国风湿病学院/欧洲抗风湿病联盟制定的RA诊断标准[7]。OA诊断将中华医学会骨科学分会在2007年制定的《骨关节炎诊治指南》(2007年版)[8]作为骨性关节炎的诊断标准。患者排除感染、贫血以及其他自身免疫性疾病。健康对照组(HC)选自兰州大学第二医院体检中心无疾病记录的健康体检者，共35例。健康对照组与RA组、OA组患者性别、年龄构成比较，差异无统计学意义(P>0.05)。所有受试者无高血压、心脏病、糖尿病等慢性系统性疾病，并排除合并其它自身免疫系统性疾病，且心、肝、肾等重要脏器功能均正常。本次研究获得兰州大学第二医院伦理委员会批准，所有患者签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 临床及实验室资料的收集 通过兰州大学第二医院患者数据库对70例RA患者的临床及实验室相关资料进行整理收集。包括:①患者一般情况：年龄、性别、疾病持续时间；②患者临床信息:疼痛持续时间、晨僵持续时间、28肿胀关节计数(Swollen joint counts，SJC)、28疼痛关节计数(Tender joint counts，TJC)、患者全身视觉模拟评分(100-mm Visual analogue scale,100-mm VAS)；③患者实验室相关指标:C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)、血沉(Erythrocyte sedimentation rate，ESR)、类风湿因子(Rheumatoid factor IgM，RF-IgM)、抗CCP抗体(anti-CCP)。并计算28关节疾病活动度评分(Disease activity score uses 28 joint counts，DAS28)[8]。

1.2.2 钙卫蛋白定量检测 收取RA组、OA组以及健康人群的血清样本，-80℃保存直到使用时取出，避免反复冻融。采用人钙卫蛋白ELISA试剂盒(武汉华美)检测血清钙卫蛋白水平。首先每孔加标准品或待测样本100 μl，覆盖板贴，37℃孵育2 h。每孔加生物素抗体工作液100 μl，覆盖新板贴，37℃孵育1 h。洗涤，每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100 μl，覆盖新板贴，37℃孵育1 h。洗涤，每孔加底物溶液90 μl，37℃避光显色15 min。每孔加终止液50 μl，5 min内用酶标仪(北京朗普)在450 nm 波长依次测量各孔的光密度(OD值)。

1.3 统计学处理 应用SPSS22.0软件进行处理，定量数据表示为[中位数(四分位数间距)，median(IQR)]。RA患者血清钙卫蛋白水平与其临床疾病活动度及实验室相关参数之间的相关性，采用Spearman进行相关分析。使用chi-square tests分析两组阳性率的差别。使用Mann-Whitney非参数检验进行单变量分析，以分析两组之间的差异。使用Kruskal-Wallis检验分析3组或更多组之间的差异，以DAS28为因变量进行多元线性回归分析。绘制受试者工作特征(Receiver operating characteristic,ROC)曲线评估钙卫蛋白对RA的诊断的价值。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料 基本资料详见表1。

2.2 血清钙卫蛋白诊断RA的敏感度和特异度 如图1所示，RA组(Median,77.7 ng/ml)和OA组(Median,28.6 ng/ml)血清钙卫蛋白水平明显高于健康对照组(Median,8.9 ng/ml)，差异具有统计学意义(P<0.01)。此外，RA组血清钙卫蛋白水平要明显高于OA组，差异具有统计学意义(P<0.01)。

表1 患者和健康对照组基本情况

Tab.1 General characteristics of patients and controls

Features[median(IQ range)]RA(n=60)OA(n=48)HC(n=35)Age(year)58.5(53.3-64.8)54.2(48.6-68.3)52.5(46.1-60.6)Male/female8/528/405/30Calprotectin(ng/ml)77.7(16.2-174.4)28.6(11.9-42.9)8.9(7.2-10.1)Disease duration(year)10.0(5.0-14.8)16.8(7.6-25.9)CRP(mg/L)17.9(6.8-25.8)ESR(mm/h)34.0(16.3-45.0)Anti-CCP(U/ml)53(18.3-143.5)RF-IgM(U/ml)205(109.8-313.8)DAS284.2(3.2-5.6)

使用ROC曲线分析(图2)，计算得到的钙卫蛋白cut-off值为46.08 ng/ml,其对于诊断RA的敏感度为63.3%,特异度为90.4%。曲线下面积0.820,95%可信区间为0.752～0.888。这说明钙卫蛋白对于RA达到中等以上诊断价值。在这个cut-off值下，RA患者中的钙卫蛋白阳性率为(38/60,63.3%)显著高于OA组(8/48,16.7%)和正常对照组(0/35,0%)(P<0.01，图3)。钙卫蛋白在RA中的阳性预测值为82.6%，阴性预测值为77.3%。因此说明钙卫蛋白可以很好地对RA组与OA组和健康对照组进行区分。

2.3 血清钙卫蛋白水平与RA临床和实验室指标之间的相关性 RA患者血清钙卫蛋白水平与其28SJC(rs=0.521,P<0.01,图4A)，28 TJC(rs=0.665,P<0.01，图4B)，DAS28(rs=0.624,P<0.01，图4C)，RF-IgM(rs=0.381,P<0.05，图4D)，ESR(rs=0.248，P<0.05,图4F)相关；而与CRP(rs=0.151,P=0.124,图4E)，抗-CCP抗体水平(rs=0.187,P=0.077,图4G)，疾病持续时间(rs=0.065,P=0.310,图4H)和年龄(rs=0.197,P=0.072,图4I)无相关性。因此说明血清钙卫蛋白表达水平可以反映RA患者的疾病活动度。

图1 钙卫蛋白在RA组和对照组中的表达情况Fig.1 Calprotectin expression in RA patients and controlsNote: The differences between RA patients and controls were determined by non-parametric Kruskal-Wallis test.Each dot represents an individual serum.Bars display median and dotted line represents cut-off values 46.08.*.P<0.01.

图2 钙卫蛋白诊断RA的ROC曲线Fig.2 ROC curves of calprotectinNote: AUC 0.5-0.7.Poor diagnostic value;Auc 0.7-0.9.Moderate diagnostic value;Auc>0.9.High diagnostic value.Std.Error=0.035，Asymptotic sig=0.001.

图3 RA组和对照组中钙卫蛋白表达的阳性率Fig.3 Positive rate of calprotectin expression in patients with RA and controlsNote: The differences between RA patients and controls were determined by Chi-square test,*.P<0.01.

图4 患者血清钙卫蛋白与RA临床个实验室指标相关性分析(n=60)Fig.4 Correlation analysis between serum calprotectin and RA clinical laboratory indicators(n=60)Note: Spearman′ s rank correlation coefficient was used to assess correlations;P-values were shown.

表2 DAS28为因变量的多元线性回归分析

Tab.2 Multivariate linear regression analysis of DAS28 as dependent variable

ModelUnstandardized coefficientsaBStd.ErrorStandardizedcoefficients BetatSig.Constant2.4770.9392.6370.011ESR0.0140.0050.2682.5710.013CRP0.0160.0080.2072.0200.048Diease duration-0.0020.019-0.009-0.0920.927Age0.0010.0170.0030.0340.973Calprotectin0.0090.0010.5575.8210.000

Note：a.Dependent Variable，DAS28 score.

2.4 以DAS28为因变量进行多元线性回归分析 结果(表2)显示在矫正CRP、ESR、年龄、疾病持续时间后，钙卫蛋白与DAS28评分相关性(P<0.01)依然存在。并且结果还提示钙卫蛋白对于DAS28评分的影响要大于CRP与ESR。

3 讨论

RA是一种病因未明的慢性、炎症性疾病，其可导致关节的损伤和功能丧失[9]。虽然RA的致死率相对较低，但会为患者带来沉重的经济负担[10]。目前使用的传统实验室指标(如CRP和ESR)反映RA疾病的活动性，因为它们只是间接反映了局部炎症的程度，特异度和灵敏度都不够理想[11]。因此迫切需要寻找用于诊断和评估RA疾病活动性的新血清标志物。

60年代中期，S100蛋白作为一种神经性蛋白在牛脑中被发现，因为其可溶于100%饱和硫酸铵，所以被称为S100蛋白[12]。钙卫蛋白属于S100钙结合蛋白家族，主要表达于中性粒细胞、树突状细胞、激活的巨噬细胞、血管内皮细胞、血小板以及成纤维细胞[13]。在细胞内，钙卫蛋白通过钙依赖性方式促进微管蛋白聚合并稳定微管蛋白，从而促进吞噬细胞迁移。在细胞外主要是从活化的或坏死的中性粒细胞和单核/巨噬细胞中释放，作为炎症蛋白质参与多种自身免疫性疾病的致病过程[14]。比如幼年特发性关节炎、炎性肠病、多发性硬化症、囊性纤维化和系统性红斑狼疮[15]，钙卫蛋白主要是通过与Toll样受体-4(Toll-like receptors-4,TLR-4)和晚期糖基化终产物受体(Receptor of advanced glycation endproducts,RAGE)结合而发挥作用，其还可加速软骨基质的钙化和骨小梁的构建，调节钙离子吸收过程中的氧化还原反应[16，17]。 Baillet 等[6]在2010年通过蛋白质组学技术发现钙卫蛋白在RA患者滑液中的表达水平较OA患者滑液中表达水平高10倍左右，提示钙卫蛋白可能参与了RA的发病过程。另外钙卫蛋白通过NF-κB(Nuclear factor kappa B)和p38MAPK(p38 mitogen-activated protein kinase)途径增强RA中炎症因子的作用也得到证实[18]。有研究发现RA患者血清中钙卫蛋白水平不但可以用来评估RA患者的药物治疗效果，而且可以预测RA患者的疾病影像学相关进展[19，20]。同时因为钙卫蛋白能直接反映RA患者滑膜和滑液的炎症活动，有研究者甚至认为钙卫蛋白有成为新的RA疾病活动生物标志物的巨大潜力[21]。

本研究结果显示，RA组血清钙卫蛋白显著高于OA组和健康对照组，且RA患者血清钙卫蛋白水平与其肿胀关节计数、疼痛关节计数、ESR、DAS28评分相关，此结果与García-Arias等[21]结果基本一致,差异之处可能是由于我们样本量不同所导致。之前有研究显示RA患者血清钙卫蛋白与其抗-CCP抗体水平和RF-IgM水平相关[22]，但最新研究结果显示RA患者血清钙卫蛋白水平与其RF-IgM水平相关，但是与抗-CCP抗体水平没有相关性[21]。我们的研究结果亦显示出RA患者血清钙卫蛋白水平与其RF-IgM水平相关，但是与抗-CCP抗体水平不相关。不同研究结果的出现可能与我们选择的患者接受了不同的药物治疗有关。因此RA患者钙卫蛋白血清水平与其抗-CCP、RF-IgM水平之间的相关性，还需要进行更大样本的深入研究，从而进一步对相关结论进行验证。从ROC曲线结果可以看出钙卫蛋白血清水平对于诊断RA 的AUC为0.820，对于RA的诊断具有中等价值。综上所述，血清钙卫蛋白对于RA的诊断，尤其是与OA的鉴别诊断具有一定意义。同时RA患者血清钙卫蛋白血清水平与其28 SJC、28 TJC、DAS28评分、RF-IgM、ESR相关。并且血清钙卫蛋白水平与DAS28疾病活动度评分的相关性要明显优于传统实验室指标CRP、ESR。表明钙卫蛋白很有希望成为新的诊断与监测RA患者疾病活动性的生物标志物。但是由于本研究只进行了横向的观察性研究，同时样本含量相对较小，相关结论还需要更大样本的深入研究来进一步验证。同时，还需进一步对钙卫蛋白作为RA患者预后评估，药物疗效预测以及治疗靶点的可能性进行探索。