路霞林，宋熙薇，曹参，王楠

作者单位：解放军东部战区总医院药品科，江苏 南京 210002

心血管疾病是终末期肾脏病（ESRD）病人死亡的主要原因［1］。近年来，随着电子束CT等一些新的检测方法在临床实践中的应用，已经发现ESRD病人的血管钙化问题非常突出。透析人群中约有54%～100%（平均83%）的病人存在不同程度冠状动脉钙化，此比例显著高于年龄相同的普通人群甚至临床上怀疑心绞痛的肾功能正常的病人［2-3］。血管钙化会促进血栓的形成、增加血管僵硬度，降低血管顺应性，增加脉压和促进动脉粥样硬化斑块破裂等严重后果［3］。血管钙化的出现被认为是动脉粥样硬化斑块不稳定的标志之一，同样也是心血管疾病的重要危险因素。除了一些传统因素如高血压，高脂血症和糖尿病外，ESRD病人血管钙化的原因很多。近年来，更多的临床证据表明，高磷、高钙血症和大量钙磷沉积与血管钙化密切相关。高钙、高磷血症导致血管钙化形成的机制尚不明确。近年来关于细胞生物学和血管影像学的研究表明，血管钙化与骨发育类似，是高度可调控的主动的生物学过程，主要特征是血管壁细胞、尤其是血管中层的平滑肌细胞的成骨样转变，但迄今血管钙化的具体发病机制尚未完全阐明［4］。

白细胞介素10（IL-10）可以由多种免疫细胞产生，例如单核巨噬细胞，树突细胞和巨噬细胞。近10年的研究证实IL-10是一种关键的免疫调节因子，具有强大的抗炎作用，它可以抑制活化的单核-巨噬细胞产生白细胞介素1α（IL-1α）、白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素 6（IL-6）、肿瘤坏死因子（TNF）、单核细胞趋化蛋白等炎症介质［5］，并且目前研究证实IL-10通过抑制T细胞核因子c1（NFATc1）的表达从而抑制破骨细胞生成［6］。血管壁中的钙化由沉积骨基质的成骨细胞和负责基质再吸收的破骨细胞调节［7］。研究发现，钙化血管中的破骨细胞积聚增加，并且伴随着巨噬细胞浸润减少。推测原因可能是血管钙化过程中巨噬细胞向破骨细胞分化造成的［8］。破骨细胞的生成以及功能受到抑制在血管钙化形成过程中发挥着关键作用，而IL-10在这一过程中具体发挥的作用目前尚不清楚。本研究自2017年6月至2018年8月年通过高磷高钙诱导大鼠胸主动脉平滑肌细胞（VSMCs）钙化，观察IL-10对大鼠胸VSMCs钙化的作用并阐明其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验分组钙浓度测定、碱性磷酸酶（ALP）活性测定、茜素红染色分为4组，包括空白对照组（Ctrl）、高磷高钙处理组（HCa+P）、20 ng/mL IL-10处理组（20 ng/mL IL-10）和高钙高磷加20 ng/mL IL-10处理组。蛋白质免疫印迹（Western Blot）和实时聚合酶链反应（Real time PCR）分为3组，包括空白对照组（Ctrl）、高磷高钙处理组（HCa+P）、高钙高磷加20 ng/mL IL-10处理组。其中钙浓度测定、ALP活性测定、茜素红染色实验每组样本量为12，Western Blot实验每组样本量为3，Real time PCR实验每组样本量为6。本研究大鼠处置方法符合动物伦理学原则。

1.2 大鼠胸VSMCs的提取无菌分离180～200g SD大鼠（n＝10）（购于北京维通利华实验动物技术有限公司）主动脉中膜，组织贴块法原代和传代培养VSMCs，实验选用传代的3～6代VSMC，并且以20%体积分数小牛血清培养的VSMC选为指数增殖细胞。通过相差显微镜的形态学特征判断和抗肌动蛋白单克隆抗体标记的免疫细胞化学染色证实培养的细胞没有内皮细胞和成纤维细胞混杂。

1.3 体外高磷高钙诱导大鼠VSMCs钙化模型的构建配置高磷高钙培养基：DMEM（含HEPES）高糖培养基，含1%青/链霉素，1%磷酸缓冲盐溶液（PBS），1.5 mmol/L氯化钙，2.0 mmol/L磷酸盐（Pi）。IL-10（R&D公司，美国）用DMEM培养基溶解后加入上述培养基中，使其终浓度为20 ng/mL。用高磷高钙培养基处理大鼠胸VSMC 3 d。

1.4 细胞钙浓度测定用PBS将12孔板中培养的细胞清洗3次，向各孔中加入500 μL 0.6mol/LHCl，在4℃下振荡24 h。操作步骤采用试剂盒：Quanti-ChromCalcium Assay Kit（DICA-500，QuantiChrom 公司，美国）的说明。配置工作液，将AB液体一比一混匀，避光。取每个样品及标准品5 μL，分别加入96孔板，后加入200μL工作液，室温振荡3 min。使用SynergyTM2 microplate reader酶标仪（BioTek公司，美国）读取612nm处吸光度。预冷PBS冲洗12孔板3次，加入0.1 mol/L NaOH/0.1%十二烷基磺酸钠（SDS），将每孔细胞刮下，4℃11 600 r/min离心20min，取上清使用BCA法测蛋白浓度。钙浓度值计算：标准化钙浓度＝绝对钙浓度/蛋白浓度。

1.5 ALP活性的测定收取24孔板中培养的细胞，各孔添加125 μL 0.05%的曲拉通X-100，冻融3次。收集每孔液体，在4℃以15 000 r/mim离心15 min。操作步骤采用使用ALP试剂盒（WAKO公司，日本）。用标准品和双蒸水制作标准曲线，将20 μL样品加入96孔板中，加入100 μL底物缓冲液，振荡2 min，37℃孵育15 min；加入80 μL反应终止液，振荡1 min，使用SynergyTM2 microplate reader酶标仪（BioTek公司，美国）测量405 nm处的吸光度（OD）值。BCA法检测样品的总蛋白浓度，计算相对ALP活性。

1.6 茜素红染色吸取12孔板培养基，用PBS漂洗3次；室温下多聚甲醛固定10 min，用PBS漂洗3次；使用95%乙醇室温固定细胞20～30 min，进一步用去离子水漂洗3遍；茜素红S（pH 4.2，合肥博美生物）染色1 min，观察有无红色结节出现，若有终止染色，若无继续染色；去离子水洗数次，洗净非特异性棕色染色为止，拍照留取图像。

1.7 实时荧光定量聚合酶链反应提取大鼠VSMCs的总RNA，使用PrimeScriptTMRT reagent Kit（Takara公司，日本）进行逆转录。实时荧光定量PCR使用Prism 7900（ABI公司，美国）系统。Taqman探针BMP2（#23 cat.no.04686977001）、骨钙素（osteocalcin，OCN（#133 cat.no.04694171001））和 Runx2（#66cat.no.04688651001）来自Roche公司（瑞士）。所有荧光定量PCR反应均重复3次，并将检测基因与管家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）标准化。根据对照组将CT值进行归一化，计算各处理组CT值。

1.8 蛋白质印迹法（Western Blot）提取大鼠VSMCs的蛋白，使用Cytoplasmic Extraction Reagents细胞裂解液（Thermo公司，美国）。细胞裂解产物使用10%的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Roche，瑞士）上，使用5%牛血清白蛋白（BSA）溶液封闭后，4℃孵育目标蛋白抗体过夜，孵育相对应辣根过氧化物酶（HRP）耦联二抗。使用显影液（SuperSignal™West Femto Maximum Sensitivity Substrate，Thermo公司，美国），ChemiDoc XRS成像系统（Bio-Rad公司，美国）曝光。Image Lab™软件用于条带灰度分析。使用的抗体如下：RUNX2抗体（1∶1 000，#12556）、p-Smad1/5抗体（1∶1 000，#9516）、Smad1/5抗体（1∶1 000，#8685）、Rankle抗体（1∶1 000，#4816）、p65抗体（1：1000，#8242）、GAPDH抗体（1∶1 000，#5174）、和 NFATc1抗体（1∶1 000，#5861）（Cell Signaling Technology公司，美国），HRP标记的羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗（1∶5 000，Cell Signaling Technology公司，美国）。

1.9 统计学方法使用GraphPad Prism 5.0软件进行数据分析。测量数据是所有测量数据并且由±s描述。使用单因素方差分析和多重比较LSD检验进行多组数据的比较。P＜0.05被认为数值间差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IL-10促进高磷高钙诱导的大鼠胸VSMCs钙化细胞内钙含量测定结果表明，高磷和高钙处理显著诱导大鼠平滑肌细胞的钙化，与高磷和高钙处理组相比，IL-10（20 ng/mL）处理组增加了细胞内钙含量（P＜0.01），并且IL-10单独处理组显示IL-10对基础状态下的大鼠平滑肌细胞中钙含量没有影响（图1A）。ALP活性结果表明，高磷和高钙处理显著增加大鼠平滑肌细胞ALP的活性，在IL-10治疗组中，与高磷和高钙处理组相比，细胞中ALP活性显著增加（P＜0.01），IL-10单独处理组显示IL-10对基础状态下的大鼠平滑肌细胞中ALP活性没有影响（图1B）。茜素红染色结果显示，高磷和高钙处理组茜素红染色呈阳性，观察到钙结节。IL-10可以显著加重大鼠平滑肌细胞的钙化程度（图1C）。

2.2 IL-10促进大鼠平滑肌细胞的成骨样分化Realtime PCR结果显示，高磷和高钙可显著诱导大鼠平滑肌细胞中成骨分化指标RUNX2，BMP2和OCN的表达。IL-10处理增加了RUNX2，BMP2以及OCN的激活，从而促进了平滑肌细胞的成骨样分化程度（图2）。

2.3 IL-10刺激后成骨细胞分化相关蛋白的表达Western Blot结果显示，高钙和高磷处理显著激活了RUNX2、p-Smad1/5、Rankle、NFATC1以及p65的表达。IL-10处理后促进了RUNX2、p-Smad1/5、p65的激活，抑制了Rankle与NFATC1的表达，发挥了显著促成骨分化作用（图3）。

图1 IL-10对血管平滑肌钙化的促进作用：A为细胞内钙含量的测定；B为细胞内ALP活性的测定；C为茜素红染色结果

图2 IL-10对成骨样分化的促进作用：A～C为RUNX2、BMP2和OCN的mRNA表达水平

图3 IL-10对成骨细胞分化相关蛋白表达的影响：A为Western Blot检测成骨分化相关分子；B为细胞总蛋白Western Blot统计；C为细胞核蛋白Western Blot统计

3 讨论

血管钙化是心血管疾病的非常重要的危险因素之一。血管钙化过程不是被动的，而是类似于骨形成和骨发育的主动调节过程。血管平滑肌细胞出现向成骨样细胞表型的转化，是血管钙化发生的细胞生物学基础。大量的研究表明，慢性肾病病人伴随的高磷血症及高血浆钙磷沉积可显著增加心血管病的发生率和死亡率，而其机制尚不清楚。在多个研究中，IL-10已被证实是血管钙化的独立危险因素［9-10］。本研究发现IL-10可促进高磷和高钙诱导的血管平滑肌钙化，并且主要通过促进高磷和高钙诱导下血管平滑肌细胞成骨样分化而发挥作用。VSMCs是血管钙化的中心环节，国内外关于IL-10直接作用的研究甚少。

BMP2是成骨细胞分化最重要的调控蛋白，体内、外均能诱导多种前体细胞发生成骨、软骨细胞表型分化。它通过自分泌、旁分泌方式作用于细胞膜上的BMPR1和BMPR2受体，主要经Smad1，5的磷酸化和转移，将信号导入细胞核内，上调转录因子Runx2等的活性，后者在成骨细胞表型分化中是必需的［11-12］。本研究发现，体外培养VSMC给予IL-10刺激后，上调成骨细胞分化调节分子BMP2及钙化相关蛋白OPN，蛋白含量检测结果与mRNA水平一致。这些特点与成骨细胞生物学行为一致，提示IL-10体外能够诱导VSMCs发生成骨样分化。我们同时还发现lL10刺激上调成骨分化标志Runx2的表达，蛋白含量检测结果与mRNA水平一致，进一步证明了IL-10促进VSMC成骨样分化的作用。

NFAT家族最初被发现在骨免疫中发挥着重要作用，NFATc1是NFAT家族中重要的一员，人类和小鼠的 NFATc1 为全长约 150 kb 的转录 DNA［13］，NFATc1是破骨细胞分化过程中的重要转录因子，在调节破骨细胞方面发挥着不可替代的作用。NFATc1的表达在成骨与破骨的平衡中发挥重要作用［14］。并且血管钙化灶内破骨细胞功能的丧失是血管钙化发生，加重并且不可逆转的重要原因［15］。本研究发现IL-10刺激可以抑制NFATc1以及RANKL的表达，从而阻断了破骨细胞的形成，抑制了破骨细胞的吞噬活性，从而间接地促进了血管钙化的发生。而RANK-RANKL系统同时也是心血管系统钙化抑制因子，缺乏可发生血管钙化［16-17］。本研究结果提示 VSMCs中的 NFATc1，RANK-RANKL系统可能参与了IL-10介导的血管钙化过程，IL-10对RANKL的抑制作用不仅促进了血管平滑肌细胞钙化的发生，同时抑制了破骨细胞的形成，从而降低了破骨细胞对血管钙化灶的吞噬吸收作用，进一步促进了血管钙化的发生与发展。

综上所述，本研究结果首次证实了IL-10体外能够直接刺激大鼠主动脉血管平滑肌细胞发生成骨样分化和钙化，这一过程伴有BMP2/Smad1，5系统的参与，促进了成骨分化标志Runx2的表达，抑制了促进破骨细胞分化的关键分子NFATc1的表达。IL-10在体内的作用广泛而复杂，血管钙化可能通过这一桥梁与其他病理过程相关，对其进行深入研究将有助于阐明血管钙化的机制，并为临床上治疗血管钙化的疾病并发症提供潜在的治疗靶点。