方翟 范文斌 高庆华

摘要：绵羊的双肌臀（Callipyge）基因表现型为后臀肌肉增大近30%，由位于绵羊第18号常染色体上基因上游存在一个N→ C的单核苷酸多态性（SNP）标记（命名为SNPCLPG）产生的，该SNP标记的存在与Callipyge表现完全吻合。为此，根据已知多态性，选择设计合成了1对引物，以多浪羊为研究对象，对PCR扩增产物直接测序，进行了SNPCLPG位点的检测。获得303 bp的扩增片断，测序后进行序列分析，发现在38 bp处碱基产生A到G的突变，在80、92、149、219 bp处碱基产生T到C的突变。

关键词：多浪羊;PCR;双肌臀;突变

中图分类号：S826        文献标识码：A        文章编号：1007-273X（2019）07-0005-03

多浪羊是新疆特有的一个优良的肉脂兼用型绵羊品种，因其中心产区在麦盖提县，故又称麦盖提羊。多浪羊体格大、产肉多、肉质鲜嫩、性成熟早、繁殖率高、遗传性能稳定。大部分母羊可达到两年三产，双羔率达30%～40%，4～5月龄羔羊体重可达35 kg;育肥性能好，育肥羊屠宰率可达55%以上，是组织羔羊肉生产的理想品种。

在绵羊的品种改良中，培育产肉量高、肉质好、嫩度高的绵羊品种一直是育种工作者不懈的追求，通过传统的遗传改良和营养调控手段来提高动物的瘦肉率和肌肉品质已很难再有大的进展。近年来，随着分子生物学技术的迅速发展和动物基因组研究的深入开展，加快了对绵羊双肌（Callipyge）性状更进一步的研究。

研究发现该性状是由于18号常染色体上的一个野生型等位基因（N）发生突变所致，而且该突变基因以非孟德尔方式遗传[1]。目前试验已证实了Callipyge突变基因以极性超显性的方式遗传。一般用C（代表突变基因Callipyge）、N（代表正常野生型基因）控制双肌性状的这一对等位基因，组成4种基因型（CC、CN、NC和NN），但仅有从父本中获得CN基因型的杂合子公羊才表现出双肌臀性状，其他3种基因型个体都表现正常。

Callipyge 的遗传效应在肉用型、毛用型和多胎型等得到了广泛的研究，其中最显著的就是提高双肌臀羊的瘦肉率这一遗传效应，Callipyge基因使双肌臀羊腰部和腿部的肌肉过度发育而显著增大;同时，该基因还能使皮下、肌间、肌内和肾脏周围的脂肪减少，进而间接地增加了绵羊的瘦肉率。Freking等[2]的研究都证明了这一观点，这和动物生产者的经济利益相关性最强。此外，Callipyge基因还对屠宰率、饲料利用率、胴体性状等产生一定的影响。

本研究采集多浪羊血液样本，设计引物，扩增CalliPyge基因，旨在验证多浪羊Callipyge基因是否存在突变。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  样品  在塔里木大学动物科学学院实验站随机选取23只多浪羊母羊，用10 mL的真空采血管（柠檬酸钠抗凝）颈静脉采血5 mL，放置在冰盒内带回实验室-80 ℃保存备用。

1.1.2  PCR引物设计  CalliPyge基因引物参照Freking[2]等在GenBank中发表的包括CLPGSNP位点的DNA序列（登录号：AF401294）设计引物，长度为303 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。上游引物Calli-F：5′-CAGCAGCAGAGCAG

AGAAC-3′;下游引物Calli-R：5′-AAATTGGAAGGC

TTGGAGGT-3′。

1.1.3  主要试剂  血液基因组DNA提取试剂盒（TIANamp Blood DNA Kit、离心柱型）（购自天根生化科技有限公司）、超纯水、EB、Marker，Buffer、5倍TAE（Tris 12.1 g、EDTA 1.86 g、醋酸2.855 mL，蒸馏水加至500 mL）。

1.1.4  主要仪器与设备  主要儀器与设备名称见表1。

1.2  方法

PCR扩增体系见表2。按照预试验所得最适退火温度为57 ℃， PCR反应优化条件为：94 ℃预变性4 min→94 ℃ 变性30 s→57 ℃ 退火30 s→72 ℃ 延伸1 min→72 ℃延伸10 min→于4 ℃保存，共进行35个循环。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

将检验合格的PCR产物编号，放置于有冰袋的泡沫箱中，密封，寄送到生工生物工程（上海）股份有限公司，双通测序。

2  结果与分析

2.1  DNA提取结果

利用试剂盒提取多浪羊血液DNA，产物经琼脂糖凝胶电泳检测，发现产物条带单一，是所需要的目的条带（图1）。

2.2  PCR扩增结果

对Callipyge基因的引物进行PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳检测，发现产物条带单一，大小稍大于300 bp，与目的片段长度303 bp大小一致（图2）。

2.3  测序结果

2.3.1  直接测序结果  生工生物工程（上海）股份有限公司的测序结果为303 bp，与目的片段长度303 bp符合。利用Chromas软件将测序结果导出，其中部分测序结果见图3。

2.3.2  碱基数目分析  通过对23个样品进行统计分析发现，碱基A占28.12%，碱基T占29.85%，碱基C占24.54%，碱基G占17.49%。其中C+G含量占42.03%，A+T含量占57.97%，A+T含量远高于C+G的含量。

2.3.3  突变分析  用NDAMAN分析，Identity=99.79%，在38 bp处碱基A突变为G，在80、92、149、219 bp处碱基T突变为C（图4）。

3  讨论

多浪羊个体大、生长发育快、早熟性好，有宝贵的多胎性和繁殖率高、采食能力强、饲料报酬高、产肉性能好、肉质鲜美可口、被毛绒毛多、毛质较好、性情温顺、遗传性稳定等特点，广受养殖户的喜爱。Callipyge基因可有效提高绵羊的瘦肉率、屠宰率和饲料利用率等性能。本研究检测了双肌臀基因在多浪羊上的表达，寻找其突变位点。王海亮等[3]研究发现第184 bp处C突变为T，证明可能与山羊双肌性状有关。刘晓敏等[4]对歐拉型藏羊Callipyge基因多态性与生长性状相关性进行研究，发现在176 bp处有N到C的突变。李云龙等[5]对宁夏回族自治区贺兰和盐池县分别采集87头滩羊、73头特克塞尔羊、70头萨福克羊和112头无角陶赛特羊的血样研究后发现，在四个绵羊品种中没有检测到决定Callipyge表型的A→G单碱基突变，但在该位点上游35 bp处检测到一个C→T的突变。

4  结论

本研究通过从多浪羊的血样中提取DNA，将提取到的DNA进行PCR扩增，将扩增产物进行直接测序，测序后利用DNAstar比对分析，在38 bp处碱基产生A到G的突变，在80、92、149、219 bp处碱基产生T到C的突变。

参考文献：

[1] YEN M Y，LIU Y C，WANG J H，et al.Streptococcus suis meningitis compli-cated with permanent perceptive deafness：report of a case[J]，Formos Med Assoc，1994，93（4）：349-351

[2] FREKING B A，KEELE J W，BEATTIE C W，et al. Evaluation of the ovine callipyge locus：I. Relative chromosomal position and gene action.[J].Journal of animal science，1998，76（8）：2062-2071.

[3] 王海亮，李祥龙，周荣艳，等.山羊Callipyge基因型的检测[J].中国畜牧兽医，2007（11）：49-51.

[4] 刘晓敏，张利平，杨  联，等.欧拉型藏羊Callipyge基因多态性与生长性状相关性研究[J].甘肃农业大学学报，2010（4）：1-4，9.

[5] 李云龙，杨章平，毛永江，等.绵羊Callipyge基因概述[J].畜牧兽医杂志，2008（2）：31-34.