刘燕，李世雄, ，尹亚丽，赵文，王玉琴

1. 青海大学畜牧兽医科学院，青海 西宁 810016；青海省畜牧兽医科学院，青海 西宁 810016 2. 三江源生态与高原农牧业国家重点实验室/青海大学，青海 西宁 810016

近年来，由于全球气候的变化以及过度放牧、害鼠破坏、风蚀、水蚀和冻融剥离等人为和自然因素的综合影响，高寒草甸草场植被和土壤受到严重破坏，草皮层剥落，土壤裸露，草地日渐退化成植被稀疏的黑土滩退化草地（杨力军等，2005）。黑土滩退化草地是以嵩草属（Kobresia）植物为建群种的高寒草甸草场退化后经风蚀和水蚀形成的大面积的或岛状的次生裸地，其海拔分布范围为3000－5000 m（尚占环等，2018；马玉寿等，2006；马玉寿等，1999）。其基本特征表现为：生草层的秃斑化，裸露土壤呈黑色，原生植被毒杂草化，莎草类基本消失。草地退化主要体现在植被逆向演替，其核心是土壤环境恶化（蔡晓布等，2007），植被-土壤-土壤微生物系统破坏，生态稳定性降低。在恢复黑土滩退化草地生态系统时，不仅要恢复植被，还要兼顾土壤环境，重建土壤微生物生态系统。

土壤微生物是草地生态系统的重要组成部分，是土壤中细菌、真菌、放线菌以及藻类的总称，其在降解土壤有机质，调节植物生长及促进土壤结构的形成等方面有着不可替代的作用（谭红妍等，2014）。土壤微生物对土壤生态变化十分敏感，能对环境变化做出快速响应并反向作用于其周围的微环境（尹亚丽等，2018；孙瑞等，2015）。分析以往文献，有关黑土滩退化草地的报道多集中于黑土滩退化草地恢复治理（李世雄等，2012；董全民等，2011）、土壤理化性质（Wu et al.，2010；周万海等，2008）及土壤酶活性（尹亚丽等，2017；韩发等，2007）等方面，鲜有对黑土滩退化草地土壤微生物群落组成及功能特征的系统研究，关于黑土滩退化草地形成机理尚不明确，且对不同地区黑土滩退化草地土壤微生物群落空间异质性的相关研究报道较少。有关黑土滩退化草地土壤微生物的研究主要侧重于微生物数量的研究，卢虎等（2014）采用平板表面涂抹法和稀释法对天祝高寒草地土壤三大类微生物和氮素生理群特征进行了研究，认为黑土滩土壤微生物主要分布在0－20 cm，三大类微生物数量以细菌最多、真菌最少；氮素生理群数量以好气性固氮菌最多、嫌气性固氮菌最少。天祝高寒生态脆弱区不同扰动生境（一年生草地、多年生草地、围栏内草地、围栏外草地和黑土滩退化草地）下，黑土滩退化草地土壤真菌及放线菌数量最多（卢虎等，2013）。然而传统的平板培养只能反映极少数微生物的信息，且所测结果误差较大（朱菲莹等，2017），因此，近年来土壤微生物多样性的研究方法从传统的培养法发展到了 Biolog微平板法、磷脂脂肪酸图谱分析法及高通量测序等生理代谢和分子生物学研究方法。其中利用Biolog-ECO微平板法对微生物群落功能多样性进行研究，可以根据不同的微生物群落对不同单一碳源的利用类型不同，反映出微生物代谢功能多样性（党雯等，2015；田雅楠等，2011）。虽然Biolog微平板法存在只能描述土壤中快速生长型或富营养微生物类群的活性，而不能反映土壤中生长缓慢的微生物信息等不足之处，但该方法可快速、简便地获得大量土壤微生物群落结构和功能多样性方面的信息，仍被认为是一种较好的研究方法（吕昌勇等，2012）。

鉴此，本研究以青海省海北、果洛、玉树3个地区黑土滩退化草地的土壤微生物为研究对象，采用 Biolog-ECO微平板法，对微生物的平均颜色变化率、微生物物种多样性指数、微生物群落功能多样性与植被特征的关系进行了研究，旨在为黑土滩退化草地植被恢复与土壤改良提供理论依据。

1 研究区域与研究方法

1.1 研究区概况

研究区位于青海省海北藏族自治州祁连县野牛沟乡（简称野牛沟YNG，年均气温1 ℃，年降水量415.5 mm）、青海省果洛藏族自治州玛沁县大武镇（简称大武DW，年均气温-3.9 ℃，年降水量513.2－542.9 mm）及青海省玉树藏族自治州玉树县巴塘乡（简称巴塘 BT，年均气温 2.9 ℃，年降水量487 mm）（表1）。三地黑土滩退化草地主要植物为细叶亚菊（Ajania tenuifolia）、冷蒿（Artemisia frigida）、臭蒿（A. hedinii）等。

1.2 试验方法

2017年8月，在野牛沟乡、大武镇和巴塘乡选择重度黑土滩退化草地作为样地。选择依据为：草地为滩地，秃斑地盖度高，可食牧草比例低，退化指示植被比例高等（马玉寿等，2008）。每个样地内设置4个400 m2的试验小区作为重复，每个小区分别调查4个50 cm×50 cm样方的植被群落特征并采集样方内草地植物地上生物量和0－10 cm及10－20 cm地下生物量，样品带回室内，在烘箱内以80 ℃烘干至恒重并计算生物量。另用直径 3.5 cm的土钻以蛇形取样法在每个小区内分别采集 5－8钻0－10 cm、10－20 cm的土样分层混合均匀，去除其中的石粒、植物凋落物和根系等，以冰盒取回实验室于 4 ℃冰箱保存用于土壤微生物 Biolog培养实验。

土壤微生物群落多样性采用 Biolog-ECO法测定，称取10 g鲜土于250 mL三角瓶中，加入90 mL 0.85% NaCl溶液，25 ℃下 200 r·min-1震荡 30 min，取上清液加入到 9 mL NaCl溶液，等比例稀释至1∶1000。向ECO微平板每孔中加入150 μL稀释液，接种好的Biolog-ECO板于25 ℃黑暗环境下培养8 d，每隔24 h在Biolog微平板读数仪上测其吸光度（宋收等，2016；郑丽萍等，2013）。

1.3 数据处理

（1）植物物种重要值（Pi）（尹亚丽等，2017）：

（2）植物物种丰富度指数（S指数）：

其中，N为每个样地的物种总数（尹亚丽等，2019）；

（3）植物Simpson优势度指数（D指数），反映群落中最常见的物种：

表1 样地基本情况Table 1 Basic conditions of sampling sites

式中，Pi为物种i的重要值（董乙强等，2018）；

（4）植物及土壤微生物Shannon-Wiener多样性指数（H指数）：

式中，Pi为物种i的重要值或ECO板上第i孔吸光值/所有吸光值之和；

（5）植物Pielou均匀度指数（E指数），用来衡量群落均一性程度：

式中，H为植物多样性指数，S为植物物种丰富度指数；

（6）平均每孔颜色变化率（Average well color development，AWCD）是反映土壤微生物碳源利用能力、土壤微生物活性和多样性大小的一个重要指标：

式中：Ci为第i碳源孔590 nm和750 nm两波段光密度差值，R为对照孔光密度值，31为 ECO板供试碳源的种类数。

（7）碳源相对利用率：培养第3天的某一类碳源类型 AWCD之和/31种碳源的 AWCD之和×100%。根据化学基团的性质将 Biolog-ECO板上的31种碳源分成6大类，即糖类、氨基酸类、酯类、醇类、胺类及酸类。

图表中数据为平均值±标准差，采用Excel 2010整理数据，利用 SPSS 25.0进行统计分析，采用CANOCO 4.5软件对土壤微生物AWCD进行趋势对应分析（DCA），采用 R3.4.3软件对数据进行Pathway富集分析、相似性分析（Ananlysis of similarities，Anosim）和冗余分析（Redundancy analysis，RDA）。采用单因素（One-way ANOVA）和Duncan法进行方差分析和多重比较（α=0.05）。利用Excel 2010和SigmaPlot 10.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 不同地区黑土滩退化草地植被特征

在YNG、DW和BT黑土滩退化草地共鉴定、分类草地植物51种（表2），不同地区间植物物种组成差异较大。3个地区黑土滩退化草地植物共有种有5种，分别是：垂穗披碱草（Elymus nutans）、细叶亚菊、矮火绒草（Leontopodium nanum）、冷蒿和肉果草（Lancea tibetica），菊科植物占优势。特有种在野牛沟有6种，大武有14种，巴塘有9种。物种重要值大于5的植物在野牛沟有细叶亚菊、直立梗唐松草（Thalictrum alpinum var. elatum）、白花栀子花（Dracocephalum heterophyllum）和裂叶独活（Heracleum millefolium），其物种重要值分别为19.15、7.60、6.49和5.90；大武有冷蒿、臭蒿、岩生忍冬（Lonicera rupicola），其物种重要值分别为25.31、15.66和8.54；巴塘有冷蒿、细叶亚菊、肉果草、白苞筋骨草（Ajuga lupulina），其物种重要值分别为26.07、11.67、8.52和6.08。3个地区黑土滩退化草地中莎草科和禾本科等优良牧草物种重要值均较小，成为群落的偶见种，而毒杂草比例较高，在畜牧业生产中已基本无利用价值。

表2 不同地区黑土滩退化草地物种组成及其重要值Table 2 Plant composition and importance value of black soil beach degraded grassland in different regions

不同地区黑土滩退化草地植物物种多样性存在差异，其中，大武草地植物物种丰富度最大，野牛沟次之，巴塘最小，分别由 16，12，11种植物组成，大武和巴塘草地植物物种丰富度差异显著（P＜0.05）（表3）。植被优势度指数、多样性指数和均匀度指数均为野牛沟＞大武＞巴塘。野牛沟黑土滩退化草地植物多样性显著高于巴塘（P＜0.05），其植被均匀度指数显著大于大武和巴塘（P＜0.05）。在0－10 cm土层，各地区地下生物量间差异显著（P＜0.05），其中，大武草地地下生物量最大，野牛沟地下生物量最小；在10－20 cm土层，大武和巴塘地下生物量显著高于野牛沟（P＜0.05）。各地区草地植物地上生物量差异达显著水平（P＜0.05），大武最大，巴塘次之，野牛沟最小。

2.2 不同地区黑土滩退化草地土壤微生物群落组成特征

不同地区黑土滩退化草地土壤微生物平均颜色变化率（AWCD）和H指数随培养时间的延长不断升高（图1），均在第1－5天迅速增加，第5天后增速减缓。对培养第 3 d（田雅楠等，2011）的土壤微生物AWCD和H指数进行方差分析，结果表明（图2），在0－10 cm土层，大武和巴塘地区土壤微生物H指数显著高于野牛沟地区（P＜0.05）；在10－20 cm土层，大武地区土壤微生物AWCD显著高于野牛沟地区（P＜0.05），各地区土壤微生物H指数差异显著（P＜0.05）。

表3 不同地区黑土滩退化草地植被特征Table 3 Vegetation characteristics of black soil beach degraded grassland in different regions

2.3 不同地区黑土滩退化草地土壤微生物群落功能特征

图1 不同地区黑土滩退化草地土壤微生物平均颜色变化率（AWCD）和Shannon-Weiner指数（H）Fig. 1 Soil microbial AWCD and Shannon-Weiner index (H) of black soil beach degraded grassland in different regions

图2 培养第3天不同地区黑土滩退化草地土壤微生物AWCD和H指数Fig. 2 AWCD and H index of soil microorganisms of black soil beach degraded grassland in different regions on the third day of cultivation

图3 不同地区黑土滩退化草地土壤微生物对6类碳源相对利用率Fig. 3 The relative utilization rates of 6 groups of carbon sources by soil microorganisms of black soil beach degraded grassland in different regions

黑土滩退化草地土壤微生物对六大类碳源相对利用率结果表明（图3），在0－10 cm土层，黑土滩退化草地土壤微生物对氨基酸类、酯类和胺类碳源的相对利用率均显著高于糖类、醇类和酸类（P＜0.05），碳源相对利用率均在19%以上；在10－20 cm土层，黑土滩退化草地土壤微生物对氨基酸类和酯类碳源的相对利用率均显著高于糖类、醇类、胺类和酸类（P＜0.05），碳源相对利用率均在22%以上。即黑土滩退化草地土壤微生物在 0－10 cm土层主要利用氨基酸类、酯类和胺类碳源，在10－20 cm土层主要利用氨基酸类和酯类碳源。不同地区黑土滩土壤微生物对六大类碳源的相对利用率在不同土层变化趋势不同，在0－10 cm土层，各地区间差异不显著；在10－20 cm土层，野牛沟和大武、巴塘的酸类和氨基酸类碳源相对利用率差异均达显著水平（P＜0.05），野牛沟地区的醇类碳源相对利用率显著大于大武地区（P＜0.05）。

利用R 3.4.3软件对黑土滩退化草地不同土层土壤微生物群落功能结构进行富集分析和相似性分析，结果显示（图4），在0－10 cm和10－20 cm土层，黑土滩退化草地利用A3、A4、B3、B4、D2、D4和 E2等碳源的功能微生物显著富集，而利用C2、C3、E4、G3和H1等碳源的功能微生物显著分异，且不同地区黑土滩土壤微生物群落功能结构均存在小的差异（R=0.375，P=0.012；R=0.3426，P=0.005）。对不同地区黑土滩退化草地土壤微生物单一碳源利用能力进行进一步方差分析，结果显示，在0－10 cm土层，差异来源于酸类（5种：B3、C3、D3、E3、H3）、氨基酸类（2种：D4、E4）、酯类（2种：C1、A3）和糖类（1种：A2）；在10－20 cm土层，差异来源于酸类（5种：B3、F2、C3、E3、F3）、氨基酸类（3种：A4、B4、E4）、醇类（2种：C2、D2）、酯类（1种：A3）、糖类（1种：G1）和胺类（1种：G4）。

图4 不同地区黑土滩退化草地土壤微生物群落富集分析气泡图Fig. 4 Pathway analysis of soil microbial communities of black soil beach degraded grassland in different regions

2.4 黑土滩退化草地植被与土壤微生物群落特征相关性分析

在0－10 cm土层，土壤微生物AWCD与植物优势度指数呈显著负相关关系（P＜0.05），与多样性指数和均匀度指数均呈极显著负相关关系（P＜0.01）（表 4）；土壤微生物 H指数与地上生物量呈显著正相关关系（P＜0.05），与0－10 cm地下生物量呈极显著正相关关系（P＜0.01），与植被均匀度指数呈极显著负相关关系（P＜0.01）。在10－20 cm土层，土壤微生物AWCD与地上和地下生物量均呈显著正相关关系（P＜0.05），土壤微生物H指数与10－20 cm土层地下生物量呈显著正相关关系（P＜0.05），与地上生物量及 0－10 cm土层地下生物量呈极显著正相关关系（P＜0.01）。即土壤微生物AWCD在0－10 cm土层与植被多样性相关性较高，在10－20 cm土层与植被生物量的相关性较高；土壤微生物H指数在0－10 cm土层与植被生物量及均匀度指数相关性较高，在10－20 cm土层与植被生物量相关性较高。

表4 土壤微生物AWCD和H指数与植被特征的相关性系数Table 4 Correlation coefficient between AWCD and H index of soil microorganisms and vegetation characteristics

2.5 黑土滩退化草地植被特征与土壤微生物群落组成的冗余分析

利用CANOCO 4.5软件对土壤微生物AWCD进行DCA分析，对不同碳源进行分组和排序，计算其第一排序轴的梯度范围，梯度范围数值小于3.0，采用RDA分析；在3.0－4.0之间，采用RDA分析和典型相关分析（CCA）均可；大于 4.0，采用CCA分析（李海云等，2018）。本试验DCA分析梯度范围数值小于3.0，用R 3.4.3对土壤微生物群落与植被特征间的相互关系进行了冗余分析，结果显示，植物生物量（地上及地下）、多样性（均匀度、多样性、丰富度和优势度指数）及重要值等变量组可以解释微生物AWCD组变化的100%，三者共同能解释88.42%的土壤微生物AWCD的变化，多样性指数、生物量、重要值的解释率分别为0%，0%和2.4%，生物量与重要值的共同解释率为4.03%，多样性和重要值共同的解释率为5.15%（图5）。

3 讨论

本研究自3个地区黑土滩草地共调查发现草地植物 51种，莎草科和禾本科优良牧草物种重要值较小，成为群落的偶见种，菊科毒杂草比例较高；草地物种组成及地上生物量均存在明显地域差异。黑土滩退化草地是极度退化的高寒草甸，其优良牧草比例显著降低，草地毒杂草化。植被的退化是土壤退化的直接原因，而土壤退化也必然引起植被退化，二者互为因果（周华坤等，2012）。不同经纬度的水热组合不同可能是导致3个地区黑土滩退化草地植被物种组成、特征指数及生物量有较大差异的原因之一。此外，3个地区黑土滩退化草地土壤碳、氮、磷等元素含量存在差异，这可能也是导致3个地区黑土滩退化草地植被群落差异的主要原因之一，但这一推测还有待进一步证实。

图5 土壤微生物群落代谢与植被特征的冗余分析Fig. 5 Redundancy analysis (RDA) on soil microbial community constrained by characteristics of vegetation

黑土滩退化草地是高寒草甸极度退化的结果，其土壤微生物AWCD显著小于未退化高寒草甸（尹亚丽等，2017），李飞等（2018）研究指出，随着草甸不断退化，土壤微生物活性逐渐降低，退化对土壤微生物碳代谢功能多样性造成显著影响。不同地区黑土滩退化草地土壤微生物群落特征存在差异。土壤微生物群落特征受诸多因素的影响，如气候、土壤理化性质、植被类型及植物生物量等。冗余分析及相关性分析表明，植被特征对不同地区黑土滩退化草地土壤微生物群落组成特征影响较大。植被可以通过调节土壤温度、含水量、pH及通气性等因素从而改变土壤微生物群落的组成和结构（单金峰，2014）。植被均匀度对土壤微生物群落结构有显著和直接的影响，本研究中，随植被均匀度增加，土壤微生物活性和多样性下降，这与Lamb et al.（2011）的研究结果不一致，其原因可能是因研究的草地类型不同而致，Lamb et al.（2011）的研究对象是糙羊茅草原植物，而本试验的研究对象是极度退化的矮嵩草高寒草甸；此外其研究是在室内栽培环境下开展的土壤微生物研究，这势必会影响土壤微生物生存的微环境，由此导致研究结果的差异。植物多样性能改变土壤微生物群落组成（Steinauer et al.，2015），草地地上、地下环境的改变也可以造成草地土壤微生物群落多样性的差异（赵轻舟等，2018）。有研究表明，微生物群落多样性随植被群落结构多样性的增加而增加（李飞等，2018；Kowalchuk et al.，2002），高生产力的植被类型具有高的土壤微生物多样性（Zak et al.，2003）。褚海燕（2013）利用高通量测序研究青藏高原土壤微生物的生物地理分布，发现青藏高原土壤细菌多样性与植物多样性呈显著正相关，土壤细菌群落组成、空间分布与植被类型极为相关，空间距离对土壤细菌空间分布有显著贡献。本研究结果显示，植被多样性指数高的野牛沟地区的土壤微生物多样性指数较低，这与以往的研究结果不一致，认为野牛沟地区虽然植被多样性指数高，但是其地上和地下生物量低，可能是导致其微生物多样性降低的主要原因。Jing et al.（2015）的研究结果也表明，高寒草地细菌多样性与植物地下生物量呈显著正相关，为本研究结果提供了进一步支持。此外，土壤总碳和全氮含量对土壤微生物多样性贡献较大，是土壤微生物群落功能多样性差异的主要影响因子（李秀清等，2019）。本研究团队测定结果显示不同地区黑土滩退化草地土壤养分含量不同，这可能是导致不同地区黑土滩退化草地土壤微生物群落组成特征另一主要原因。

土壤微生物能将土壤中的多糖、蛋白质、脂肪等大分子营养物质分解成单糖、氨基酸、脂肪酸等小分子物质（尹亚丽等，2018）。本研究中的黑土滩退化草地土壤微生物群落功能特征具有明显的垂直分布规律，在0－10 cm土层，土壤微生物主要利用氨基酸、酯类和胺类碳源；在10－20 cm土层，主要利用氨基酸和酯类碳源。微生物的活动与植物根系生物量及有机质含量分布有关（姚拓等，2005），上层土壤地下生物量高于下层土壤，且 3个地区黑土滩退化草地植物重要值大于5的植物根系主要分布在0－10 cm土层，这可能是导致上下土层间碳源利用差异的主要原因。不同地区黑土滩退化草地土壤微生物对碳源的利用存在差异，植物功能类群的不同会导致草地微生物功能类群表现出差异（Strecker et al.，2015），不同地区黑土滩退化草地植物群落结构不同，其返回土壤的植物凋落物的质量和数量以及植物根系也存在差异，由此导致不同地区黑土滩退化草地的土壤微生物群落功能差异。裂叶独活仅在野牛沟地区有分布，且重要值较高，其根长约20 cm，这可能是导致在10－20 cm土层，野牛沟地区黑土滩退化草地土壤微生物对酸类和氨基酸类碳源相对利用率显著高于和大武和巴塘地区的原因。植物根系分泌物能为土壤微生物提供必要的碳源，植物通过调节根系分泌物对土壤微生物进行调控，以便从土壤中吸取更多的营养物质，满足自身生长需要。但不同植物的根系分泌物种类和数量存在一定的差异，根系发达的植物根际土壤中根系分泌物和脱落物的种类和数量更多（陈悦等，2018），根系分泌物能改变植株周围的土壤微环境，并对土壤微生物产生不同的生态效应，从而影响了微生物的数量和区系组成（谭红妍等，2014；赵吉等，1999），进而影响微生物群落功能多样性。郭静（2015）研究认为土壤微生物对6种碳源的利用率与土壤有机质含量呈极显著相关，土壤微生物对碳水化合物利用率与土壤含水率呈显著正相关，本试验3个地区黑土滩退化草地的土壤养分含量与含水量有所不同，这可能也是3个地区土壤微生物群落功能存在差异的原因之一。

富集分析结果显示，黑土滩退化草地土壤微生物对碳源的利用出现了显著的富集和分异。黑土滩退化草地是高寒草甸草场严重退化的产物，草地毒杂草化。退化草地的群落优势种和伴生种多被发现具有化感作用，如乳白香青，冷蒿，黄帚橐吾，细叶亚菊，甘肃马先蒿，白苞筋骨草，露蕊乌头，披针叶黄华等（平晓燕等，2018；任元丁等，2014）。虽然本研究并未直接测定 31种碳源中哪些碳源属于化感自毒物质，但已有研究证实2-羟基苯甲酸和4-羟基苯甲酸是重要的化感自毒物质（董艳等，2013），本研究中，3个地区黑土滩退化草地土壤微生物对4-羟基苯甲酸的利用率较大，可认为其是土壤微生物适应这种有化感自毒的物质，并能够利用化感物质来满足自生的生长需要，适应退化草地的土壤微环境。

4 结论

黑土滩退化草地植被毒杂草化，优良牧草比例极低，不同地区黑土滩退化草地植被群落组成和土壤微生物群落组成存在差异。植被均匀度指数、多样性指数、优势度指数及生物量对土壤微生物群落组成特征有较大影响。不同土层黑土滩退化草地主要利用的碳源类型不同，在0－10 cm土层，黑土滩退化草地土壤微生物主要利用氨基酸、酯类和胺类碳源；在10－20 cm土层，主要利用氨基酸和酯类碳源。黑土滩退化草地土壤微生物对碳源的利用出现显著富集和分异。不同地区的黑土滩退化草地土壤微生物对碳源的利用存在差异，在 0－10 cm土层，差异主要表现在酸类、氨基酸类和酯类，在10－20 cm土层，差异主要表现在酸类、氨基酸类和醇类。土壤微生物 AWCD与植被均匀度指数呈极显著负相关关系，土壤微生物H指数与植被生物量呈显著正相关关系。88.42%的土壤微生物AWCD变化是由草地植物生物量、多样性及重要值三者共同解释的。