刘云峰，李海岛，李 正，蔡 芳，徐飞鹏

益心舒片收载于《中国药典》2015 版，由人参、麦冬、黄芪、五味子、丹参、川芎及山楂提取制成，具有益气复脉、活血化瘀、养阴生津之功效[1]。临床主要用于气阴两虚、瘀血阻脉所致的胸痹，证见胸痛胸闷、心悸气短、脉结代，冠心病心绞痛见上述证候者。其中丹参是处方中主药之一，丹酚酸B 是丹参中的主要药效成分，也是益心舒片中的主要药效成分之一。丹酚酸B 具有抗动脉粥样硬化、抗不稳定心绞痛、抑制肝纤维化、保护肾脏、抗肿瘤及防治糖尿病并发症等药理作用[2-6]。关于丹参提取物和中药复方中丹酚酸B 的药动学研究已分别有报道[7-15]，而国内还没有关于丹参提取物及其复方制剂中丹酚酸B 的药动学差异比较的相关报道。为考察益心舒片中丹酚酸B 在体内过程是否受中药配伍的影响，本次研究对大鼠分别灌胃丹参提取物和益心舒片，通过药动学研究来阐明传统中药复方配伍具有一定的合理性和科学性。

1 材料与方法

1.1 实验材料 清洁级SD 雄性大鼠（江苏大学动物实验中心提供），体重250～300 g。Waters e2695 型高效液相色谱仪（PDA 检测器）；高速冷冻离心机（Sigma公司）；BP211D 电子天平（Sartorius 公司）；微量移液器（Thermo 公司）；RE501 旋转蒸发仪（西安远舰仪器厂）；HH 恒温水浴锅（江苏金坛市中大仪器厂）；涡旋震荡器（江苏金坛市中大仪器厂）；冷冻干燥机（赛飞公司）。甲醇（HPLC，honeywell 公司）；乙腈（HPLC，默克公司）；丹参提取物【自制，高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）测得丹酚酸B 含量为12.984 mg/g】；丹酚酸B 对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111562-201514）；益心舒片（贵州信邦制药股份有限公司，国药准字Z20090491，批号：180703，RP-HPLC 法测定丹酚酸B 含量为2.839 mg/g；注射用水（江苏吉贝尔药业股份有限公司自制）；其余试剂为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱：ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 µm）；检测波长：286 nm；流动相：甲醇-乙腈-0.5%甲酸水溶液（27 ∶7 ∶66）；流速：1.0 ml/min；柱温30 ℃。

1.2.2 配制对照品溶液 取丹酚酸B 对照品适量，精密称定，加甲醇稀释制成每1 ml 含0.1012 mg 的溶液，即得。

1.2.3 丹参提取物的制备 称取丹参药材适量，加85%的乙醇加热回流提取2次，第一次3 h，第二次1.5 h，滤过，合并提取液，减压回收乙醇，浓缩至相对密度约为1.12～1.15 的清膏，经冷冻干燥后，备测。经HPLC 法测得丹酚酸B 的含量为12.984 mg/g。

1.2.4 血浆预处理 采用微量移液器吸取血浆100 μl，加0.2 ml 甲醇，涡流振荡2 min，13 000 r/min 高速离心7 min，取上清液，用0.45 μm 微孔滤膜滤过，备用。

1.2.5 药动学研究 随机将12 只SD 雄性大鼠平均分成2 组，给药前禁食12 h，可以自由饮水，实验前将丹参提取物和益心舒片（去薄膜衣后）分别用1%羧甲基纤维素钠分散，灌胃给药，给药剂量按丹酚酸B折算均为60 mg/kg，并于给药前和给药后0.083、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24 h 眼 眶 后静脉丛取血，置EP 管中，按“1.2.4”项处理后测定。

1.2.6 药物动力学参数及统计学处理 根据所获得的血浆中丹酚酸B 的峰浓度Cmax及达峰时间Tmax，药动学参数均由Excel 2010 软件处理，计量数据以表示，其他药动学参数采用DAS 2.0 软件进行拟合处理，以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 专属性 分别取空白血浆、加入丹酚酸B 对照品的空白血浆、灌胃丹参提取物的血浆样品及灌胃益心舒片的血浆样品，按“1.2.4”项处理，分别进针，色谱图见图1。由图可见，分离效果好，专属性强。

2.2 线性范围、检测限 精密吸取“1.2.2”项下丹酚酸B 对照品溶液适量置1 ml 离心管中，加入100 µl 大鼠空白血浆，按“1.2.4”项处理对照品溶液，配制成丹酚酸B 浓度分别为0.253、0.506、1.012、2.530、5.060、10.120 µg/ml 的血浆样品，进样分析，以测得的峰面积（Y）对血药浓度（X）进行线性回归，标准曲线为Y=74.752X+1537（r2=0.9996）（n=6），血浆中丹酚酸B 在0.253～10.120 µg/ml 之间呈良好线性关系，丹酚酸B 检测限为0.063 µg/ml。

2.3 加样回收试验 精密吸取空白血浆100 µl 置于1 ml 离心管中，计18 份，分成三组，每组6 份，精密加入丹酚酸B对照品适量，按“1.2.4”项下方法操作，分别配制成1.012、2.530、5.060 µg/ml的3种浓度样品，分别测定丹酚酸B 含量，并计算加样回收率，结果见表1。

2.4 精密度试验 取丹酚酸B 浓度为1.012、2.530、5.060 µg/ml 的3 种不同浓度的血浆样品，分别日内、日间各测定5次，计算日内、日间的精密度，结果见表2。

表1 丹酚酸B 加样回收试验（n=6，）

表1 丹酚酸B 加样回收试验（n=6，）

加入量/µg·ml-1 测得量/µg·ml-1 回收率/% 相对标准偏差/% 1.012 0.979±0.024 96.74 2.45 2.530 2.467±0.039 97.51 1.58 5.060 4.963±0.081 98.08 1.63

表2 丹酚酸B 精密度试验（n=6）

表2 丹酚酸B 精密度试验（n=6）

加入量/ µg•ml-1日内 日间测得量/µg·ml-1相对标准差/%测得量/µg·ml-1相对标准偏差/% 1.012 0.982±0.025 2.55 0.977±0.028 2.87 2.530 2.483±0.042 1.69 2.474±0.044 1.78 5.060 4.974±0.087 1.75 4.953±0.089 1.80

图1 丹酚酸B 在大鼠血浆样品中的HPLC 色谱图

2.5 提取回收率 取上述的丹酚酸B 浓度为1.012、2.530、5.060 µg/ml 的血浆样品（n=6），按“1.2.4”项下方法处理，进入色谱仪测定，得到丹酚酸B 平均峰面积A1；另取空白血浆100 µl，先不加对照品溶液，其他操作按“1.2.4”操作，得到上清液之后，向上清液中加入适量的丹酚酸B 对照品溶液，使丹酚酸B 浓度也分别为1.012、2.530、5.060 µg/ml 的样品，分别进入色谱仪，得到丹酚酸B 平均峰面积A2，计算3 个不同浓度的血浆样品中丹酚酸B 的提取回收率（R=A1/A2×100%）。3 个不同浓度的提取回收率分别达到84.7%、87.9%和88.5%，其相对标准差分别为3.3%、2.6%和2.7%。

2.6 稳定性实验 取含有丹酚酸B 浓度为2.530 µg/ml的大鼠血浆样本分别经室温即时测定、室温放置24 h后测定、冷藏室内（4℃）放置3 d 后测定、反复冻融3 次测定，以及零下20℃冷冻储藏1 月测定，结果表明丹酚酸B 血浆样品在各条件下均有良好稳定性。

2.7 药动学参数 本次实验对得到的血药浓度-时间的数据用DAS 2.0药动学软件进行拟合计算，其平均药-时曲线见图2，主要的药动学参数见表3，结果表明，丹参提取物和益心舒片中的丹酚酸B 在大鼠体内的药代过程非常类似，且益心舒片药动学参数更优。

3 讨 论

图2 丹酚酸B 在大鼠体内的药-时曲线

表3 丹酚酸B 在大鼠体内的主要药动学参数（n=6，）

表3 丹酚酸B 在大鼠体内的主要药动学参数（n=6，）

注：与丹参提取物组比，①P＜0.05

参数 益心舒片 丹参提取物 t1/2β（h） 0.182±0.133 0.194±0.176 t1/2Ka（h） 0.426±0.051① 0.612±0.056 AUC0 →t（µg·h·ml-1) 3.225±0.286① 1.775±0.403 AUC0 →∞（µg·h·ml-1) 3.397±0.293① 1.982±0.475 Tmax（h） 1 1 C max （µg·ml-1） 2.587±0.229① 1.723±0.172

在本研究中，方法具有良好的专属性，空白血浆无干扰，丹酚酸B 与其他内源性成分分离效果良好，且在此色谱条件下，血浆中丹酚酸B 的理论塔板数不低于2 500；血浆中丹酚酸B 在0.253～10.120 µg/ml 之间线性关系良好，血浆中丹酚酸B 检测限为0.063 µg/ml，能很好地通过检测要求；在实验中，分别于日内和日间各测定5 次3 种不同浓度的血浆样品，日内及日间精密度均符合要求；本方法具有良好的提取回收率，满足实验要求；稳定性实验表明，丹酚酸B 血浆样本在各条件下均有良好稳定性。

实验前期，分别采用固相萃取法及有机溶剂蛋白质沉淀法作为丹酚酸B 血浆样品的预处理方法。多次比较后发现固相萃取法提取丹酚酸B，回收率较低，且与有机溶剂蛋白质沉淀法相比，操作比较繁琐，所以优先选择有机溶剂蛋白质沉淀法。笔者还分别采用不同有机溶剂来处理血浆样品，发现采用甲醇来沉淀血浆效果比较理想，且流动相中本身含有甲醇，对检测影响较小。在甲醇用量方面，发现甲醇用量的加大，血浆杂质峰数量并没有明显减少，反而会影响丹酚酸B血浆样品的测定，经过多次试验，最终将血浆-甲醇的体积比确定为1 ∶2。本实验中采用甲醇沉淀蛋白提取丹酚酸B 的样品前处理，操作简单、便捷、高效，符合药动学研究的要求。实验初期，采用2015 版中华人民共和国药典一部所载的益心舒片中丹酚酸B 的测定方法，用于本次药动学研究中血浆样品的丹酚酸B检测，但通过前期的摸索研究，笔者尝试微调了流动相中有机相比例，丹酚酸B 与周围的其他成分能很好地分离。笔者分别对两组大鼠进行灌胃给予丹参提取物和益心舒片后，丹酚酸B 的药动学研究显示，灌胃益心舒片后，益心舒片中的中药配伍能明显影响丹酚酸B 在大鼠的体内过程，具有明显提高丹酚酸B 的生物利用度效果。

整体观是中医理论的基础，中药复方是中医用药的传统精髓。由于中药在临床上辨证用药均以复方为主，单味中药的药动学研究难以代表复方的药动学特征。研究复方的药动学特征，应以复方本身为研究对象，并考虑复方中的中药配伍等关系，才能得到较为准确的数据。本研究表明，丹参提取物和益心舒片中丹酚酸B 的药动学特征存在着较大差异，益心舒片中的其他配伍中药成分可明显增加丹酚酸B 在大鼠体内的吸收，表明了中药配伍给药在临床上确实有一定的合理性，配伍给药能够明显改善某些有效成分的体内吸收。在研究中，笔者也意识到复方制剂中仅以其中所含的个别成分的药代动力学结果来断定复方制剂的整体药代动力学特征，还缺乏相应的科学依据，这也是今后需要在中药复方制剂药代动力学研究中重点考虑的问题。