蒙姜宇 傅 鹰,2 贺亚军,* 钱 伟

1 西南大学农学与生物科技学院,重庆 400716；2 浙江省农业科学院作物与核技术利用研究所,浙江杭州 310021

油菜是我国主要的油料作物,菜籽油是我国主要的食用植物油之一[1]。除了需求量大外,随着人们生活水平的提高,对食用油的品质也提出了更高的要求。而脂肪酸的组成决定了菜籽油的品质[1]。菜籽油的脂肪酸组成主要有棕榈酸(C16：0)、硬脂酸(C18：0)、油酸(C18：1)、亚油酸(C18：2)、亚麻酸(C18：3)、廿碳烯酸(C20：1)、芥酸(C22：1)等[2]。其中油酸(oleic acid,OAC)和亚油酸(linoleic acid,Llei)对人体具有较好的营养和保健作用[3],而亚麻酸(linolenic acid,Llen)是人体必需脂肪酸,但其不饱和程度高,易于氧化,降低了菜籽油的存放期[4-5]。因而,理想的食用菜籽油脂肪酸组成除了要求无芥酸外,还要高油酸、高亚油酸和低亚麻酸[6]。

目前,国内外关于油酸、亚油酸、亚麻酸含量的QTL 定位已有不少研究[7-13]。Tanhuanpää 等[7]最先在白菜型油菜中发现2 个控制油酸含量的QTL,并将其定位在FAD2基因。Schierholt 等[8]以甘蓝型油菜高油酸材料,证明该性状是由位于A5 连锁群的FAD2基因控制,Hu 等[9]证实了这一发现。张洁夫等[10]用甘蓝型油菜BC1F1群体检测,构建出19 个连锁群组成的分子标记图谱,扫描出2 个与油酸含量相关的主效QTL,位于N8 和N13 连锁群,分别解释11.73%和27.14%的油酸含量变异；3 个与亚油酸含量相关的QTL,2 个位于N8 连锁群,1 个位于N13连锁群,主效QTL 位于N8 连锁群,解释13.25%的亚油酸含量变异；3 个与亚麻酸含量相关的微效QTL,分别位于N1、N8、N11 连锁群,分别解释5.12%、6.83%、6.89%的亚麻酸含量变异。杨燕宇等[11]用甘蓝型油菜F2代作图群体,在A5 和C5 连锁群各检测到1 个与油酸含量相关的主效QTL,A5 上的QTL 贡献率大于49%,与FAD2基因紧密连锁,两区域具有同源性；定位在A5 和C5 的油酸含量QTL 也被确认为亚油酸含量主效QTL；在A4、A5 和C4 连锁群上共检测到 3 个亚麻酸含量的主效 QTL,共解释72%～80%亚麻酸含量变异。蔡东芳等[12]用全基因组关联分析的方法检测到93 个显著关联的标记位点,分别解释3.04%～38.34%的表型变异,其中49 个标记在不同年份被同时检测到；15 个标记与多个性状共关联,其中9 个与油酸和亚油酸共关联。Yang 等[13]的研究也证实甘蓝型油菜位于A05 染色体上的主效QTL 调控油酸含量升高。尽管关于油酸、亚油酸、亚麻酸含量性状的QTL 有许多研究,但在这些QTL定位中,由于作图群体与标记类型等不同,分析结果差异较大,很难比较或互相验证不同研究结果。因此,有关油酸、亚油酸、亚麻酸含量性状的遗传研究仍需要进一步深入。

本研究利用甘蓝型油菜的双单倍体(doubled haploid,DH)群体和永久F2(immortalized F2,IF2)群体,分别在4 个和2 个年份条件下油酸、亚油酸、亚麻酸含量相关QTL 进行检测,以期发现更多有关油菜籽脂肪酸含量相关的QTL,为油菜脂肪酸品质改良提供有用的遗传信息。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以德国冬性甘蓝型油菜Express 和中国半冬性甘蓝型油菜SWU07 为亲本,杂交得到F1代,取F1代的花粉进行小孢子培养,经染色体加倍,得到包含261 个株系的DH 群体[14]。根据Hua 等[15]的组配方案构建IF2群体。利用DH群体中的234个株系,随机分成2 组,每组117 个株系,两两随机组合,通过一轮杂交,共组配117 个杂交组合,再通过一轮随机组配,共获得234 个杂交组合。2 个试验年度的杂交组合完全相同。

1.2 田间试验与表型调查

Express、SWU07、DH 群体和IF2群体都种植于重庆市北碚区西南大学油菜工程研究中心试验基地。2010年、2011年、2012年、2013年共4年种植DH群体,2010年、2011年共2年种植IF2群体。采用完全随机区组设计,每个株系3 次重复,每个重复30 个单株；每小区(2.4 m × 1.2 m = 3.0 m2)种3 行,每行10 株,行距0.40 m,株距0.24 m。每年9月中旬在苗床上人工播种,10月下旬移栽到大田,按常规方式进行田间管理,保证所有材料的外部生长环境一致,次年花期套袋自交,5月份籽粒成熟时,收获正常植株的自交种5 g 以上,干燥后取3 g 用近红外(NIRS)分析仪测定每个株系5 个单株的种子油酸、亚油酸、亚麻酸含量[16]。

1.3 数据处理

利用 Microsoft Excel 2003 统计 Express 和SWU07 的5 个单株上述性状的平均值及DH 群体和IF2群体各参数,如平均数、最小值、最大值、标准差,并进行t测验。使用SAS V8 软件分析DH 群体和IF2群体各性状及性状间相关性。

1.4 遗传连锁图谱与QTL 分析

所用的遗传图谱包含293 个SSR 多态性标记位点,总长 1188 cM,相邻标记间平均距离为 4.05 cM[14]。用WinQTL Cartographer 2.5 软件的复合区间作图法对油酸、亚油酸、亚麻酸含量QTL 定位[17]。扫描时,设背景标记数目为5,扫描窗口10 cM,扫描步长1 cM,P=0.05,进行1000 次的排布检验[18]。当LOD≥2.5 时,认为这个置信区间的QTL 存在；当同一性状的QTL 在不同群体或者不同年份中被同时检测到,且置信区间在同一染色体上发生重叠时,认为是同一QTL。按照“q 所在连锁群名称-性状英文缩写-年份群体-与该性状相关的第几个”方式命名QTL,如qA01-OAC-2010DH-1即DH 群体在2010年检测到的与油酸含量相关的QTL,位于A01 连锁群,是与该性状相关的第1 个QTL。

2 结果与分析

2.1 表型分析

亲本Express 和SWU07 的油酸、亚油酸、亚麻酸含量多年的平均值均存在明显差异(表1),DH 和 IF2群体的油酸、亚油酸、亚麻酸含量都表现出连续变异,并且存在明显的双向超亲分离现象(表2和图1),表明这3 个性状均为多基因控制的数量性状。

表1 亲本油酸、亚油酸、亚麻酸含量的分析 Table1 Analysis of OAC,Llei,and Llen contents in parental lines(%)

表2 DH 和IF2 群体油酸、亚油酸、亚麻酸含量的分析 Table2 Analysis of OAC,Llei,and Llen contents in DH and IF2 populations(%)

2.2 相关性分析

表3表明,在DH 群体中,同一性状在4年间的表型均呈极显著正相关(P＜0.0001)；在IF2群体中,同一性状在 2年间的表型也呈极显著正相关(P＜0.001)。说明油酸、亚油酸、亚麻酸这3 个性状均遗传稳定。

表4表明,不管是DH 群体还是IF2群体,在同一年份的环境条件下,油酸与亚油酸、亚麻酸含量都呈极显著负相关(P＜0.0001),亚油酸与亚麻酸含量呈极显著正相关(P＜0.0001)。在不同群体、不同年份环境条件下,性状间相关系数在程度上存在略微的差异,但在方向上是一致的,说明这3 个性状在遗传上受群体类型的影响小,不同的群体类型可反应出相似的遗传相关性。

2.3 油酸含量QTL 分析

2 个群体多个年份环境下共检测到24 个与油酸含量相关的QTL。其中,在DH 群体中4 个年份环境下共检测到21 个与油酸含量相关的QTL,在IF2群体中2 个年份环境下共检测到3 个与油酸含量相关的QTL(表5和图2)。这些QTL 分布在甘蓝型油菜的7 条连锁群(A01、A02、A04、A05、A07、A09、C01)上,分别揭示了3.44%～13.97%的种子油酸含量表型变异。贡献率大于10%的QTL 有5 个,分别是qA09-OAC-2010DH-5、qA09-OAC-2010DH-6、qC01- OAC-2010DH-8、qC01-OAC-2010DH-9和qC01- OAC-2012DH-18。24 个与油酸含量相关的QTL 中,qA09-OAC-2010DH-7、qA09-OAC-2011DH-10和qA09-OAC-2013DH-20 在不同年份环境中被重叠检 测到,qC01-OAC-2010DH-8、qC01-OAC-2011DH-12和qC01-OAC-2013DH-21在不同年份环境中被重叠检测到,qC01-OAC-2010DH-9和qC01-OAC- 2012DH-19在不同年份环境中被重叠检测到,qC01- OAC-2011DH-11和qC01-OAC-2012DH-18在不同年份环境中被重叠检测到。将这些不同年份环境中重叠检测到的QTL 整合为4 个可重复的位点,通过整合这些可重复性的位点,最终得到18 个与油酸含量相关的位点。

图1 DH 群体和IF2 群体油酸、亚油酸、亚麻酸含量的频率分布 Fig.1 Frequency distribution of OAC,Llei,and Llen contents in DH and IF2 populations

表3 DH 群体和IF2 群体同一性状在不同年份间的相关性分析 Table3 Correlation analysis of the same trait in different years in DH and IF2 populations

表4 DH 群体和 IF2 群体在同一年份下不同性状间的相关性分析 Table4 Correlation analysis of different traits in the same year in DH and IF2 populations

表5 DH 群体和IF2 群体中检测到的与油酸含量相关的QTL Table5 Putative QTLs for OAC detected in DH and IF2 populations

图2 油酸、亚油酸、亚麻酸含量QTL 在连锁群上的分布 Fig.2 QTLs for OAC,Llei,and Llen on different linkage groups

2.4 亚油酸含量QTL 分析

在DH 群体中4 个年份环境下共检测到20 个与亚油酸含量相关的QTL,在IF2群体中2个年份环境下均未检测到与亚油酸含量相关的QTL(表6和图2)。这些QTL 分布在甘蓝型油菜的5 条连锁群(A02、A06、A09、C01、C02)上,分别揭示3.84%～19.51%的种子亚油酸含量表型变异。贡献率大于10%的QTL 有10 个,分别是qA09-Llei-2010DH-2、qA09-Llei-2010DH-3、qA09-Llei-2010DH-4、qC01-Llei-2010DH-5、qA09-Llei- 2011DH-7、qA09-Llei-2012DH-10、qA09-Llei-2012DH- 11、qA09-Llei-2012DH-12、qA09-Llei-2013DH-16和qA09-Llei-2013DH-17。20 个与亚油酸含量相关的QTL中,qA09-Llei-2010DH-2、qA09-Llei-2012DH-10和qA09-Llei-2013DH-15在不同年份环境中被重叠检测到,qA09-Llei-2010DH-3、qA09-Llei-2011DH-7、qA09-Llei-2012DH-11和qA09-Llei-2013DH-16在不同年份环境中被重叠检测到,qA09-Llei-2010DH-4和qA09-Llei-2013DH-17在不同年份环境中被重叠检测到,A09-Llei-2011DH-8和qA09-Llei-2012DH-12在不同年份环境中被重叠检测到,qC01-Llei- 2010DH-5和qC01-Llei-2013DH-19在不同年份环境中被重叠检测到。将这些不同年份环境中重叠检测到的QTL 整合为5 个可重复的位点,通过整合这些可重复性的位点,最终得到12 个与油酸含量相关的位点。

2.5 亚麻酸含量QTL 分析

2 个群体多个年份环境下共检测到31 个与亚麻酸含量相关的QTL,其中,在DH 群体中4 个年份环境下共检测到30 个,在IF2群体中2 个年份环境下检测到1 个(表7和图2)。这些QTL 分布在甘蓝型油菜的11 条连锁群(A01、A02、A03、A04、A05、A08、A09、C01、C02、C03、C06)上,分别揭示2.86%～11.91%的种子亚麻酸含量表型变异。贡献率大于10%的QTL 有2 个,分别是qC01-Llen-2010DH-6、qC01-Llen- 2010DH-7。31 个与亚麻酸含量相关的QTL 中,qA02-Llen-2010DH-2和qA02-Llen-2013DH-26在不同年份环境中被重叠检测到,qA03-Llen-2011DH-12 和qA03-Llen-2013DH-27在不同年份环境中被重叠检测到,qC01-Llen-2010DH-6、qC01-Llen-2011DH-17、qC01-Llen-2012DH-22和qC01-Llen-2013DH-28在不同年份环境中被重叠检测到,qC01-Llen-2010DH-7和qC01-Llen-2012DH-23在不同年份环境中被重叠检测到,qC02-Llen-2011DH-20、qC02-Llen-2012DH-25、qC02-Llen-2013DH-30和qC02-Llen-2011IF2-31在不同年份环境中被重叠检测到,qC06-Llen-2010DH-10和qC06-Llen-2011DH-21在不同年份环境中被重叠检测到。将这些不同年份环境中重叠检测到的QTL 整合为6个可重复的位点,通过整合这些可重复性的位点,最终得到21 个与亚麻酸含量相关的位点。

表6 DH 群体中检测到的与亚油酸含量相关的QTL Table6 Putative QTL for Llei detected in DH population

3 讨论

甘蓝型油菜是重要的油料作物,油酸、亚油酸和亚麻酸作为菜籽油的主要脂肪酸组分,是衡量油菜品质的关键指标。通过提高油酸和亚油酸含量、 降低亚麻酸含量来改良菜籽油品质,是当前油菜品质育种的重要目标之一。

本研究在不同群体、不同年份环境条件下,油酸、亚油酸和亚麻酸这3 个脂肪酸组分都表现出相互间很高的相关性,这与前人研究结果一致[19-21]。油酸含量与亚油酸含量、亚麻酸含量都为极显著负相关,亚油酸含量与亚麻酸含量又表现为极显著正相关,这种相关性与三者的合成代谢途径相吻合。硬脂酸去饱和之后形成不饱和脂肪酸油酸(C18：1),而油酸在FAD去饱和基因作用下形成亚油酸(C18：2),而亚油酸又是亚麻酸(C18：3)的合成前体。因此油酸、亚油酸和亚麻酸相互间有较高的相关性[20,22]。对于同一性状,IF2群体中不同年份间相关系数比DH 群体低。由于IF2群体是由DH 群体两两杂交而获得的,除了可以用DH 群体检测性状的加性效应和上位性效应外,还可以用IF2群体检测性状的显性效应,鉴定出在杂交后代中能传递和表达的显性效应QTL。这一结果表明基因显性效应和基因间显性上位性互作更易受环境的影响。

表7 DH 群体和IF2 群体中检测到与亚麻酸含量相关的QTL Table7 Putative QTL for Llen detected in DH and IF2 populations

本研究共检测到75 个QTL,去掉在不同年份和群体中置信区间相互重叠的QTL 之后,共得到3 个品质性状的51 个QTL,其中有15 个在2年以上环境中被检测到。在51 个QTL 中,47 个来自DH 群体,只有4 个来自IF2群体,前者远远高于后者。这可能有2 方面的原因,其一是IF2群体由DH 株系两两杂交而来,因此缩减了IF2群体的表型差异,造成QTL检测的分辨能力减弱。其二是IF2群体开展的试验数少于DH 群体。

甘蓝型油菜油酸含量受 2～6 对基因控制[8,23]；亚油酸、亚麻酸均受2 对以上基因控制。除受主基因控制外,脂肪酸组分还可能受其他修饰基因的影响[24-26]。前人研究中多次报道,与油酸含量相关的主效QTL 位于A5 和A8 连锁群上[9,10,23,27-28],与亚油酸含量相关的QTL 位于A8 和C4 连锁群上[10,27-28],与亚麻酸含量相关的QTL 位于A4 和C4 连锁群上[9]。本研究检测到与油酸含量相关的QTL 分布于A01、A02、A04、A05、A07、A09、C01 连锁群,揭示3.44%～13.97%的油酸含量变异；与亚油酸含量相关的QTL 分布于A02、A06、A09、C01、C02 连锁群,揭示3.84%～19.51%的亚油酸含量变异；与亚麻酸含量相关的QTL 分布于A01、A02、A03、A04、A05、A08、A09、C01、C02、C03、C06 连锁群,揭示2.86%～ 11.91%的亚麻酸含量变异。多年环境下重复检测到与油酸和亚油酸含量相关的QTL 都位于A09、C01连锁群,与前人研究结果具有一致性[6,27-29]；与亚麻酸含量相关的QTL 位于A02、A03、C01、C02、C06 连锁群。与前人研究结果比较[2,6-9,11,13,27,29-30],本研究检测到21 个未被报道过的新QTL,其中8 个与油酸含量相关,分别是qC01-OAC-2010DH-8、qC01-OAC-2010DH-9、qC01-OAC-2011DH-11、qC01- OAC-2011DH-12、qC01-OAC-2012DH-17、qC01- OAC-2012DH-18、qC01-OAC-2012DH-19、qC01- OAC-2013DH-21,都在C01 连锁群；1 个与亚油酸含量相关的QTLqA06-Llei-2011DH-6位于A06 连锁群；12个与亚麻酸含量相关,分别是qA02-Llen-2010DH-1、qA02-Llen-2010DH-2、qC06-Llen-2010DH-9、qC06- Llen-2010DH-10、qA03-Llen-2011DH-12、qA03-Llen- 2011DH-13、qA04-Llen-2011DH-14、qA05-Llen-2011DH- 15、qA05-Llen-2011DH-16、qC06-Llen-2011DH-21、qA02-Llen-2013DH-26、qA03-Llen-2013DH-27,分别位于A02、A03、A04、A05、C06 连锁群。这些新的QTL 将为甘蓝型油菜脂肪酸组分的改良提供重要的遗传信息。

4 结论

利用DH 群体和IF2群体共检测出75 个QTL。其中在不同年份环境下重复检测到15 个QTL,位于A02、A03、A09、C01、C02、C06 染色体上。共检测到21 个未被报道过的新QTL,其中8 个与油酸含量相关,都位于C01 染色体；1 个与亚油酸含量相关,位于A06 染色体；12 个与亚麻酸含量相关,分别位于A02、A03、A04、A05、C06 染色体。