种猪精液检测中移液器的应用

2019-08-19张凤鸣潘红梅

兽医导刊 2019年22期

朱丹张凤鸣陈东潘红梅*

（1.重庆市畜牧科学院/农业部养猪科学重点实验室/重庆市养猪工程中心，重庆 402460；2.四川省苍溪胰河乡畜牧兽医站，四川苍溪 628427）

随着猪人工授精技术的普及，种猪常温精液产品已被广大养猪人接受。大部分小型猪场和散养户已不再饲养种公猪，而是直接购买制作好的种猪常温精液用于配种。种猪常温精液在生产前、生产后及使用前，都必须要经过严格的质量检查和评价，质量合格的精液方能用于发情母猪输配。其中，种猪精液稀释前检查原精的活力和原精的密度尤其重要。根据国家标准《种猪常温精液》（GB-23238-2009）的要求，原精稀释后的种猪常温精液产品精液剂量为80～100ml，精子活力≥60%，每剂量精液中直线前进运动精子数≥25亿。其中每剂量中精子数以血球计数板计数精子，获得原精的密度值。检测计算公式为：每剂量中精子数=5个中方格中的数子数×5（即25个中方格的总精子数）×10（1mm3内的精子数）×1000（每毫升精液的精子数）×20（精液稀释倍数）/50（根据原精密度大小调整）×剂量值。此计算公式可简化为：每剂量中精子数=5个中方格中的数子数×100万/250万×剂量值。由此计算公式可知，准确取样进行检测是确保获得准确的原精密度值，准确确定精液稀释倍数，保证种猪常温精液产品质量的基本前提。在取样过程中，即使是很小的取样误差都会对检测结果产生显著影响。

传统的玻璃取样吸管或刻度管因其粗糙的制作、精度差和操作麻烦等原因已被精密度高，操作方便的微量移液器取代，目前，手动微量移液器已被广泛应用于种猪精液抽样和精液质量检测中。与所有的精密仪器一样，若采用正确的操作技术使用移液器，并在使用过程中注意所有的操作细节，其结果有很强的可重复性。不幸的是，种猪常温精液生产单位和质量检测单位的技术人员很少或根本没有接受过规范的移液器操作和养护培训，在检测过程中正确的移液器操作技术和必须注意的细节常被忽视，且移液仪器的定期校准和适度保养基本被忽略。笔者长期从事种猪精液质量的检测和抽检工作，深感正确使用移液器的重要性和目前技术推广中问题的严重性，故总结此文，以供同行参考。

1 移液器的分类

自1956年德国科学家Heinrich·Schnitger发明可调式移液器至今，移液器已发展出繁多的种类，其分类方法也各不相同。

根据移液器的物理学原理可分为空气置换式移液器（或气体活塞式，Air displacement）和正向置换式移液器（或外置活塞式，Positive Displacement）两种。空气置换式移液器适用于标准溶液移液，例如水、缓冲液、稀释的盐溶液和酸碱溶液。其活塞位于移液器的内部，通过活塞的伸缩改变空气体积，同时产生压力从而提供液体移动原动力即液体的吸取或排放，活塞与液体不接触。正向置换移液器主要应用于黏稠度较大的液体如糖浆、甘油等，易挥发溶液，易产生气泡的液体的移液。需要配合专用的吸头使用，其活塞位于移液器外，置于吸头/毛细管内部，通过活塞的伸缩引起液体的移动。活塞与液体直接接触，两者之间没有空气段，可以更好地保护液体样本，最大限度地避免交叉污染，能提高粘滞液体吸入或排出量的准确性和精密度。

根据移液器所用动力分，可分为手动移液器和电动移液器。根据移液器所带吸头的数量分，可分为单通道移液器和多通道移液器。

种猪精液检测实验室常用的移液器为手动单道移液器。这是一种量出式量器，其移液量是由一个配合良好的活塞在活塞套内移动的距离来确定。主要由显示窗、容量调节部件、活塞、O-形环、吸引管和吸头（也称枪头）等部分组成。

2 手动单道移液器常用的移液技术

移液器的正确操作技术是完成合格检测的第一步，错误的操作容易产生移液偏差，导致实验结果不准确。在精液检测中因为原精稀释倍数大，取样量小，检测人员必须掌握正确的移液技术，减少检测结果的误差。

2.1 正向移液技术

空气置换式移液器的操作按钮有两个位置：第一停点和第二停点。如图1所示，当使用正向移液技术吸液时，先用大拇指将操作按钮按下到第一停点（1.准备），再将移液吸头浸入到样品中，然后缓慢释放操作按钮回原点，吸入所需要的样品量（2.吸液）。吸出样品后，需要用吸水纸吸干吸头外多余的样品，以确保移出的样品量为实验所需要的设定量。排液时，先将吸头紧贴容器壁，按下操作按钮到第一停点，排出吸头内的样品（3.排放一）。为了让吸头内的样品全部排完，操作按钮的第一停点稍加停顿后，还需继续将操作按钮按压至第二停点（4.排放二），排尽吸头内所有样品后再缓释放操作按钮回弹至原位，最后松开按钮（5.复原）。

正向置换式移液器只能采用正向移液技术进行操作。

图1 正向移液技术操作示意图

2.2 反向移液技术

反向移液技术一般用于转移高粘液体、生物活性液体、易起泡液体或极微量的液体。

如图2所示，当使用反向移液技术吸液时，直接将操作按钮压至第二停靠点（1.准备），再将吸头浸入样品液面，同时控制操作按钮缓慢回弹至原位，再松开操作按钮，吸入所需要的样品量（2.吸液）。排液时，先将吸头紧贴容器壁，把操作按钮按至第一停点，排出吸头内的样品（3.排放），随后将吸头顶部剩余的样品废弃或还原至容器，释放操作按钮至原点（4.复原）。

图2 反向移液技术操作示意图

3 精液检测中适用的移液器和移液技术

精液稀释剂一般是普通的盐溶液，可以用空气置换式移液器和正向移液技术进行操作。不推荐用反向移液技术移取水性溶液，因为这个技术在吸取水性溶液时，吸取的样品量往往会超过仪器校准时确定的量。

无论是原精还是稀释精液都属于黏性液体，在取样移液时应对其进行特殊考虑。使用空气置换式移液器和正向移液技术对精液样品进行取样时可能会产生不准确的结果，因为吸液时，精液会在吸头的内壁形成一层薄膜，导致排液时样品不能完全从吸头内排尽。因此，在移取精液样品时推荐使用正向置换式移液器或空气置换式移液器的反向移液技术。

移取精液样品时，先将液体吸入，再打出，重复2～3次进行吸头浸润，致吸头内壁吸附一层液体，使吸头内表面达到饱和，最后将吸取的精液样品移至目的容器，这样操作吸取的样品体积会更准确，特别注意在排液前要仔细擦干净吸头外壁的液体。

4 精液检测中的移液器使用技巧

4.1 量程的选择和调节方法

首先要根据取样量选择合适量程的移液器。虽然移液器的可用量程范围是移液器最大量程的10～100%，但移液体积越接近所选移液器的最大量程，移液的准确性越好。如需要取样70μl，最好选择最大量程为100μl的移液器，而不用最大量程为200μl的移液器。

调节量程的正确方法应为：当移液器的量程需要从大体积调为小体积，按照正常的调节方法，即逆时针旋转旋钮至目标量程即可；当移液器的量程需要从小体积调为大体积时，则可先顺时针旋转刻度旋钮至超过目标量程的刻度，再回调至目标量程，这样可以保证量取的最高精确度。这样的操作可以排除移液器内部机械间隙造成的影响，使移液更加准确，而且整个调节过程要注意动作轻缓。

特别注意，千万不能将调节旋钮旋出量程，否则会卡住内部机械装置而损坏移液器。

4.2 吸头填充方法

在精液检测实验中，检测人员常习惯将移液器下端垂直插入吸头，并上下强力敲打吸头，以期使吸头紧密地填充上紧。但这种填充吸头的方法会影响移液器的气密性导致吸液不准，长期如此操作还会造成移液器内部零件因经常性的撞击而松散，甚至会导致调节刻度的旋钮卡住，影响移液器的使用。

填充吸头的正确方法为将移液器下端垂直插入吸头，左右小幅度旋转上紧即可。

4.3 浸润吸头有利于提高精液取样准确性

移取精液样品时，由于精液有一定的黏稠度，会在吸头上形成挂壁现象，因此移液时最好先润洗吸头。具体方法是吸液时先将液体吸入，再打出，重复2～3次进行吸头浸润，这样吸头壁会吸附一层液体，使吸头内表面达到饱和，再吸液后排出的体积会更准确。浸润过程还可以帮助检查是否有气密性不好导致的漏液现象。

吸液后，保持吸头在液面下停留几秒，使移液器的弹簧充分回弹至设定位置再把移液器拿出，可以提高吸液量的准确性，避免因弹簧回弹不充分，吸头下方进入部分空气和气泡影响吸液的准确性。

4.4 吸头取样角度和浸入深度

移液吸头浸入液面的角度不同对移液效果也会有影响，刘丽[1]通过实验证明垂直加样是准确度最好的吸液角度。同样移液吸头浸入液体的深度对移液量也会有一定的影响。浸入过浅，可能会吸入空气，导致移液量不准；浸入过深，可能会因为额外增大的压力致移液量偏高。刘丽的实验结果显示吸头浸入深度在4～10mm时比较，吸取血清、水、异戊醇和无水乙醇的变异系数分别为0.12、0.09、0.39和0.24，远小于浸入深度＜4mm和＞lOmm的结果。说明移液时吸头浸入液面达到4～10mm时吸液准确性明显提高。