程鹏飞

（大理农林职业技术学院，云南大理 671003）

野菊花具有广谱抗菌、抗病毒、降血压、清除氧自由基、增加冠脉血流量、抗动脉粥样硬化、抗凝血、镇痛、抗肿瘤等作用，不仅被用于风热感冒、肺炎、口疮、痈疽等疾病的治疗，而且在治疗心血管疾病、脑供血不足、早期神经退行性病变和调节血脂水平等方面也有良好的疗效，在中兽医疗法中也被广泛应用[1]。野菊花化学成分复杂，其品质和制剂品质的评定没有统一的标准，过量服用野菊花也会有一定的毒副作用，黄酮类化合物是野菊花的主要药效成分[2]，将野菊花黄酮制备成脂质体不仅可以提高疗效，降低其毒副作用，还可以较好的控制脂质体制剂的质量和药用剂量[3]。因此，野菊花黄酮脂质体有很好的研究价值和应用前景。

1 试剂与仪器

1.1 药材与试剂

野菊花：购于杨凌华仁堂大药房；芦丁标准品（批号100080-200707），中国药品生物制品检定所；大豆磷脂（批号20140304），上海太伟药业有限公司；胆固醇（批号F20140312），国药集团化学试剂有限公司；鱼精蛋白（批号20140930-1020A022）Sigma公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器

PL-2002型电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；UV-3802H紫外-可见分光光度计，上海尤尼柯仪器有限公司；RE-52A旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；TGL-16S型台式高速冷冻离心机，四川蜀科仪器有限公司；BSA224S-CW型电子天平等。

2 方法

2.1 野菊花黄酮提取、分离和纯化

采用乙醇回流法提取，聚酰胺树脂分离和纯化[1]；制备了3批黄酮样品，置于-20℃冰箱储存备用。

2.2 总黄酮含量测定

2.2.1 芦丁标准液的配置

精密称取干燥至质量恒定的芦丁标准品24.4mg，加适量60%乙醇充分溶解，转入100 ml的容量瓶中，用60%乙醇定容，即配置成0.244mg/ml的芦丁标准液。

2.2.2 标准曲线的制作

准确称取1.3334g的 AlCl3，用适量60%乙醇溶解，并定容至100ml，即配置成0.1mol/L的AlCl3溶液。分别精密量取芦丁标准液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml于25ml的容量瓶中，各加入0.1mol/L 的AlCl3溶液1ml，再用60%的乙醇定容，摇匀，静置20min；以不加芦丁标准液为空白最照，在波长415nm处测定吸光度值[1]，并绘制标准曲线。将所得吸光度的值与浓度的关系列于表1。

表1 芦丁标准液浓度与吸光度值

得芦丁标准曲线回归方程为：Y=31.455X-0.0093，R2=0.9991（图1），式中Y为溶液在415nm处的吸光度，X为芦丁标准液的浓度。

图1 芦丁标准液的吸光曲线

2.2.3 样品黄酮含量测定

分别于3批样品中取样0.0046g、0.0052g、0.0081g，用适量60%乙醇充分溶解，置于25 ml容量瓶中，各加入0.1mol/L 的AlCl3溶液1ml，再加60%乙醇溶液定容，测量吸光度值，并带入曲线计算得到3批样品黄酮含量分别为10.9%、10.4%、11.2%。样品平均黄酮含量为10.83%。

2.3 野菊花黄酮脂质体制备试验

2.3.1 BBD响应曲面设计

脂药比、膜材比、超声时间是野菊花黄酮脂质体包封率的主要影响因素，以此3个因素为自变量，每个因素选择3个水平（如表2），以脂质体包封率为指标。

表2 野菊花黄酮脂质体制备工艺响应面试验设计因素及水平

采用响应面软件（Design-Expert 7.1.6）中的Box-Behnken Design设计试验，并进行试验，计算出每一组试验中脂质体的包封率，并用该软件对试验结果进行分析，筛选出最佳的制备条件组合。试验设计及结果见表3。

2.3.2 野菊花黄酮脂质体的制备

采用薄膜分散法[4]结合超声辅助法，按试验设计分别称取卵磷脂、胆固醇和野菊花黄酮样品粉末，用10ml无水乙醇和10ml氯仿充分溶解，然后减压旋转蒸发除去有机溶剂，在烧瓶内壁形成薄膜，加入PBS液20ml，继续旋转至膜完全溶解，按试验设计时间进行超声处理，再分别过0.45μm和 0.22μm的微孔滤膜，即制成野菊花黄酮脂质体。

2.3.3 脂质体包封率的测定

吸取野菊花黄酮脂质体0.5ml于1ml锥形离心管中，加入0.5ml鱼精蛋白（10mg/ml）混匀，过夜，在4℃下，13000rpmin离心25min，吸取上清液于25ml的容量瓶中，加入0.1mol/L的AlCl3溶液1ml，再用60%乙醇溶液定容，按上述芦丁标准法测定其吸光度，并代入标准回归方程计算得黄酮含量，即游离药物量[4]。脂质体包封率按照下列公式计算：

η=（C总-C游）/C总×100%

式中：η为脂质体包封率；C总为脂质体悬液中包封黄酮量与游离黄酮量之和；C游为游离黄酮含量。

3 结果与分析

3.1 试验结果

试验结果见表3，对结果进行响应面分析，经过二次回归拟合，得到野菊花黄酮脂质体的包封率对脂药比（A）、膜材比（B）、超声时间（C）的二次多项回归方程为：

Y=76.32-5.50A+8.16B-2.31C+4.58AB-1.72AC+2.70BC-8.94A2-20.91B2-5.61C2

表3 Box-Behnken试验设计及结果

利用该软件对结果进行多元线性回归拟合，并对模型进行方差分析，结果见表4，模型P=0.0005＜0.01，表示模型极显著，说明该模型成立，本实验方法可靠。失拟项P=0.7092＞0.05，不显著，表明该回归方程拟合度较好，没有失拟因素存在。进一步说明在试验范围内可以用来解释和预测试验结果。模型中的B、A2、B2对野菊花黄酮脂质体包封率的影响极显著，A、AC、C2对野菊花黄酮脂质体包封率的影响显著，同时结合F值的大小，可以知道B（膜材）比对野菊花黄酮脂质体包封率影响最大，其次是A（脂药比），即膜材比＞脂药比＞超声处理时间。

表4 响应面方差分析

3.2 响应面工艺优化分析

利用 Box-Behnken模块可以做出以两两自变量为坐标轴的3D图和等高线图（图2、图3，以脂药比和膜材比为例，固定水平为超声时间20min，A为脂药比，B为膜材比，R1为包封率），这些图不仅可以很好地揭示每个自变量对因变量的影响程度，也能直观地反映自变量之间的交互作用。

图2 脂药比和膜材比响应曲面

图3 脂药比和膜材比等高线图

通过该软件模型对野菊花黄酮脂质体的制备条件进行优化，最优条件为脂药比9.49：1，膜材比8.32：1，超声处理时间18.71min。为了操作方便，将最优条件调整为脂药比9.5：1，膜材比8.0：1，超声处理时间19min。在此条件下制备的野菊花黄酮脂质体包封率为77.82%。通过3组试验验证，分别测得包封率为77.69%、76.98%和76.86%，重现性较好。

4 结论

目前制备野菊花黄酮脂质体的方法主要有薄膜分散法、乙醇注入法和超声法等，本试验采用薄膜分散法结合超声辅助法，来制备野菊花黄酮脂质体。与乙醇注入法相比，薄膜分散法结合超声处理制备得到的脂质体粒径均匀，多为单室脂质体[1]。但是，薄膜分散法在减压蒸发，形成薄膜的终点难以确定，有机溶剂蒸发速度过快等，都将导致制成的脂质体粒径不均一，包封率低。正交试验虽然能处理离散的水平值，并且能精确到某一个具体的点，但其无法找出整个范围内因素的最优值及最佳组合条件[5]，响应面法克服了此缺点。采用响应面法，通过对影响因素的等高线图、3D图和多元线性回归拟合，并对模型进行方差分析，综合得出每一个因素对野菊花黄酮脂质体包封率影响的显著性水平，以及最佳值和最佳条件组合。

采用薄膜分散法结合超声辅助法制备野菊花黄酮脂质体，并用Design-Expert（7.1.6）软件分析优化制备条件，得到最佳条件为脂药比9.5：1、膜材比8：1、超声处理时间19 min，在此条件下制备的野菊花黄酮脂质体包封率为77.82%，重现性较好。