黄慧娟 乔玉洁 张军东

上海建华精细生物制品有限公司 上海 201611

玻璃酸钠注射液适用于变形性膝关节病，肩关节周围炎。玻璃酸钠注射液注入关节腔内，可覆盖和保护关节组织，改善润滑功能；改善关节炎患者日常活动及关节活动范围[1]。玻璃酸钠注射液作为注射剂应严格控制样品中的细菌内毒素含量，避免临床使用中热原反应的发生，。国家食品药品监督管理局国家药品标准-玻璃酸钠注射液（标准号：WS1-（X-058）-2006Z-2011）中细菌内毒素应小于0.1EU/mg；而日本药典（JP XVII）[2]中玻璃酸钠注射液细菌内毒素的限度为应小于0.03EU/mL。为了提高产品的质量保障水平，增强国际竞争能力，本文将按照2015年版《中国药典》四部通则1143细菌内毒素检查法[3]建立动态显色法检测玻璃酸钠注射液细菌内毒素含量的方法。

1 实验材料与方法

1.1 仪器

LKL164-03（64孔）动态试管检测仪（湛江安度斯生物有限公司）；Eppendorf微量取液器（50～1000µl）；细菌内毒素检查用水，无热原试管及无热原枪头（湛江安度斯生物有限公司）；QL-901型漩涡混匀器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；BS124S分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）

1.2 药品与试剂

动态显色法鲎试剂（湛江安度斯生物有限公司，批号1804200，灵敏度0.005～50EU/mL）；细菌内毒素检查用水（厦门市鲎试剂实验厂有限公司，批号18016003，5.0ml/支）；细菌内毒素工作标准品（中国食品药品检定研究院，批号150601-201885，80EU/支）；细菌内毒素工作标准品（厦门市鲎试剂实验厂有限公司，批号160301，15EU/支）；玻璃酸钠注射液（上海建华精细生物制品有限公司自制，批号1803291、1804201、1805101，规格 2.5ml：25mg）

2 方法

2.1 细菌内毒素限值（L）的确定

依据日本药典（JP XVII）中玻璃酸钠注射液细菌内毒素限值标准（应小于0.03EU/mL），确定本品细菌内毒素检查限值为应小于0.03EU/mL。

2.2 标准曲线的可靠性试验

将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解稀释，用漩涡混匀器溶解完全后进一步进行梯度稀释得到细菌内毒素标准品浓度分别为50，5，0.5，0.05，0.005EU/mL的标准品溶液，各取0.1ml分别加至含有0.1ml鲎试剂的反应管中，混合后插入动态试管检测仪中，每个浓度平行3管进行检测，并以2管细菌内毒素检查用水作空白对照。检测温度为37℃±1℃，设置波长为405nm，达限值为92%，反应时间为3600s，仪器自动以细菌内毒素标准品浓度的对数（lgC）为横坐标，反应时间的对数（lgT）为纵坐标绘制标准曲线，得到标准曲线方程并计算相关系数。

2.3 最小有效稀释浓度（C）的确定

供试品C计算公式为C=λ/L，式中L为供试品的细菌内毒素限值0.03EU/mL，λ为标准曲线上最低的内毒素浓度0.005EU/mL，得出供试品的C为0.167ml/ml。

2.4 干扰试验

根据2015年版《中国药典》四部通则1143细菌内毒素检查法规定，，本试验选择0.5EU/mL为λm，添加至供试品中进行供试品干扰试验。取三批玻璃酸钠注射液各1g，精密称定，用细菌内毒素检查用水分别稀释至0.167ml/ml，即为供试品溶液；同时用供试品溶液制备含有细菌内毒素浓度为0.5EU/mL的溶液为供试品阳性溶液。取细菌内毒素工作标准品1支加入细菌内毒素检查用水1ml，置涡旋混合器上混合5分钟，即得标准储备溶液，用细菌内毒素检查用水将标准储备液梯度稀释至5EU/mL，0.5EU/mL，0.05EU/mL，0.005EU/mL，即为细菌内毒素系列标准溶液；细菌内毒素检查用水为阴性对照。依照“1.3.2”项下方法测定，其中细菌内毒素系列标准溶液平行3管，其他溶液平行2管。仪器自动按所得线性回归方程分别计算出供试品溶液和供试品阳性溶液的内毒素含量并得出该试验条件下的回收率，应在50%～200%之间。

2.5 样品的细菌内毒素检查

取3批样品进行检测，计算供试品细菌内毒素含量，以EU/mL表示，并进行样品细菌内毒素回收率的测定。

3 结果

3.1 标准曲线的可靠性

根据2015年版《中国药典》四部通则1143细菌内毒素检查法规定，当阴性对照的反应时间大于标准曲线最低点反应时间，将全部数据进行线性回归，根据线性回归分析，标准曲线的相关系数的绝对值大于或等于0.980，各组平行试管的变异系数均小于10%，试验方为有效。经检测，标准曲线得到回归方程lgT=2.7224-0.2701lgC，相关系数绝对值为0.9999，标准曲线可靠性试验有效，试验结果见表1。

表1 动态显色法标准曲线可靠性试验结果

3.2 干扰试验结果

玻璃酸钠注射液在稀释至0.167ml/ml的浓度下内毒素的回收率均在50%～200%的范围内，表明在该稀释倍数下不存在增强或抑制的干扰作用，且测得的内毒素数据真实有效。供试品干扰试验结果见表2。

表2 供试品干扰试验结果

3.3 样品中细菌内毒素检测结果

采用上述动态显色法对三批玻璃酸钠注射液样品进行细菌内毒素含量测定。标准曲线方程lgT=2.5490-0.2744lgC，相关系数为0.9985，计算样品浓度0.167ml/ml下的细菌内毒素含量，供试品原液内毒素含量均＜0.005EU/mL，样品浓度为0.167ml/ml，得到样品细菌内毒素含量均＜0.03EU/mL，且试验结果均符合有效性要求，检验结果符合限度要求。

4 讨论

本研究通过2015年版《中国药典》四部通则1143细菌内毒素检查法以及参考文献资料[4-8]，建立了动态显色法检测玻璃酸钠注射液细菌内毒素含量的方法，研究结果表明玻璃酸钠注射液在6倍稀释浓度下的样品溶液不存在干扰作用，检测三批次自制样品，结果显示样品细菌内毒素含量均＜0.03EU/mL，符合日本药典（JP XVII）中玻璃酸钠注射液细菌内毒素限值标准。动态显色法是检测反应混合物的吸光度或透光率达到某一预先设定的检测值所需要的反应时间，该方法相比常用的凝胶法能够准确的测出细菌内毒素的含量，且操作简便，数据具有可追溯性。本研究试验方法稳定，能准确检测样品中的细菌内毒素含量，可用于玻璃酸钠注射液产品细菌内毒素含量的测定。