李道宽 彭芸花△，2

(1.兰州大学第一医院，甘肃 兰州 730010；2.海南医学院第二附属医院，海南 海口 570102)

白藜芦醇(Resveratrol)是一类提取自葡萄籽、芦荟、虎杖等植物的多酚类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等作用[1]。已有大量研究发现其与临床抗肿瘤药物联合使用表现出更好的抗肿瘤效果[2-7]。其致死性的主要原因是肿瘤的治疗失败、复发及转移，在转移中，上皮间质细胞转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)扮演了重要促进作用[8]。逆转由肿瘤微环境所导致的EMT将显著延长宫颈癌患者总生存期[9-10]。目前已有多种治疗策略通过逆转EMT，阻止甚至逆转癌症的进一步恶化，其中联合治疗方法或联合用药是最常见的策略[11-13]。白藜芦醇与5-FU联合使用的抗肿瘤效果已在肝癌、乳腺癌等肿瘤中得到证实[14-15]，但是其在宫颈癌中对EMT的影响未见报道。因此，本研究选取宫颈癌细胞系HeLa细胞作为研究对象，探索白藜芦醇联合5-FU对宫颈癌细胞转移及其EMT的影响，为临床更好地治疗宫颈癌提供基础数据。报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂 HeLa细胞购买自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。H-DMEM培养基、FBS购自海科伦公司；MTT购自索莱宝公司；Transwell小室购自Millipore公司；MMP-2和MMP-9 Elisa检测试剂盒购买自上海酶联生物；RIPA裂解液、SDS-PAGE凝胶电泳试剂盒、ECL发光液购自碧云天公司；兔抗人N-cadherin多克隆抗体、兔抗人E-cadherin多克隆抗体、兔抗人Twist1多克隆抗体、兔抗人Snail1多克隆抗体、兔抗人Vimentin多克隆抗体购自博奥森生物公司，山羊抗兔荧光二抗购自CST公司。

1.2 方法 (1)细胞培养：用HDMEM培养基将HeLa细胞培养于37℃、5%CO2培养箱中，每3天换一次液，待细胞生长至80%融合度时，以1∶3进行传代培养。(2)MTT实验：将生长至80%融合度的HeLa细胞用胰酶消化，以含有10% FBS的HDMEM培养基配制成浓度为1×105个/mL的单细胞悬液，并以每孔100μL加到96孔板中，37 ℃、5% CO2培养箱培养过夜，待贴壁后，白藜芦醇和5-FU 均以0、10、20、40、80、160 μmol/L的浓度梯度加入到孔中；联合组以50 μmol/L的白藜芦醇联合10、20、40、80、160 μmol/L 梯度的5-FU加入到孔中。加完药后，于37 ℃、5% CO2培养箱继续培养24 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL ，培养箱中培养4h，弃去培养基，每孔加入150 μL DMSO溶解MTT，于490 nm处进行酶标仪检测OD值。(3)Transwell小室迁移实验：取处于对数生长期的HeLa细胞，按照约1×106个/mL配制无血清的单细胞悬液，于Tranwell小室上室中加入400 μL单细胞悬液，下室中加入含20% FBS的培养基，加药，其中白藜芦醇组加入终浓度为50 μmol/L的白藜芦醇，5-FU组加入终浓度为50 μmol/L的5-FU，联合组加入50 μmol/L的白藜芦醇和50 μmol/L的5-FU，空白组加入相同体积的DMSO；待细胞均匀沉降后，放入培养箱作用24 h后取出，-20 ℃甲醇固定15 min，棉签轻轻拭去未迁移过去的细胞，结晶紫染色，PBS洗涤，拍照计数。(4)免疫荧光实验检测Vimentin表达：取处于对数生长期的HeLa细胞，按照约1×105个/孔，接种于6孔板，按照1.2(2)项下分组处理细胞，24 h后，PBS洗涤细胞，4%多聚甲醛室温固定30 min，PBS洗涤，透膜20 min，PBS洗涤，室温封闭30 min，4 ℃孵育一抗过夜(其中以1∶200稀释Vimentin抗体)，PBS洗涤，室温孵育二抗2 h(以1∶400稀释荧光二抗)，PBS洗涤，荧光显微镜拍照。(5)Elisa实验检测MMP-2、MMP-9表达：按照1.2(2)项下分组处理处于对数生长期的HeLa细胞24h后，收集上清，按照Elisa试剂盒说明书进行实验：设置标准孔和实验孔，标准孔加入梯度标准品，实验孔加入待测样品，37 ℃孵育30 min，洗涤，加入酶标试剂(空白孔不加)，37 ℃孵育30 min，洗涤，显色10 min，终止显色，15 min内上机于450 nm处检测OD值。(6)Western bloting实验检测N-cadherin、E-cadherin、Twist1、Snail1蛋白表达：取处于对数生长期的HeLa细胞，按照约1×106个/孔，接种于6孔板，待细胞生长至80%融合度时，按照1.2(2)项下分组处理细胞，药物处理24 h后，吸取培养基，用PBS洗涤细胞3次，加入RIPA裂解液在冰上裂解细胞，待细胞裂解后收集于离心管中，继续裂解30 min，13 000 rpm离心，收集上清，测定蛋白浓度，加入4×上样缓冲液，煮沸5 min，充分变性，-20 ℃保存备用。制胶：10%分离胶+5%浓缩胶；按蛋白浓度确定上样量；然后经过电泳，转膜，封闭，一抗孵育过夜，PBS洗涤，二抗室温孵育1.5h，PBS洗涤，ECL发光液显色，X射线片显影，拍照，用Image pro plus软件对光密度值进行分析。

2 结 果

2.1 白藜芦醇联合5-FU对HeLa细胞增殖的影响 白藜芦醇、5-FU以及二者联合用药均以浓度依赖的方式抑制HeLa细胞的增殖。其中在相同浓度下，联合用药对HeLa细胞增殖抑制率均大于5-FU 和白藜芦醇单独用药，其中单独用药时白藜芦醇的IC50为61.42 μmol/L，5-FU的IC50为26.13 μmol/L，联合用药IC50为18.75 μmol/L。见图1。

图1 白藜芦醇、5-FU以及联合使用对HeLa细胞增殖的影响

2.2 白藜芦醇联合5-FU对HeLa细胞迁移的影响 与空白组相比，白藜芦醇组、5-FU组以及联合组HeLa细胞迁移数目依次下降。见图2。

图2 白藜芦醇、5-FU以及联合使用对HeLa细胞迁移的影响

2.3 白藜芦醇联合5-FU对HeLa细胞Vimentin蛋白表达的影响 与空白组细胞相比，白藜芦醇组、5-FU组以及联合组细胞中Vimentin蛋白表达逐渐降低。见图3。

图3 白藜芦醇、5-FU以及联合使用对HeLa细胞Vimentin蛋白表达的影响

2.4 白藜芦醇联合5-FU对HeLa细胞N-cadherin、E-cadherin蛋白表达的影响 与空白组细胞相比，白藜芦醇组、5-FU组以及联合组细胞中N-cadherin蛋白表达逐渐下降，E-cadherin蛋白表达逐渐增加。见图4。

图4 白藜芦醇、5-FU以及联合使用对HeLa细胞N-cadherin、E-cadherin蛋白表达的影响

2.5 白藜芦醇联合5-FU对HeLa细胞MMP-2、MMP-9表达的影响 与空白组相比，白藜芦醇组、5-FU组以及联合组细胞上清中MMP-2、MMP-9水平逐渐降低。与白藜芦醇组和5-FU组相比，联合组细胞上清中MMP-2、MMP-9水平显著下降。见表1。

表1 各组细胞上清中MMP-2、MMP-9含量变化

注：与空白组相比，*P<0.05；与白藜芦醇组和5-FU相比，△P<0.05。

2.6 白藜芦醇联合5-FU对HeLa细胞Twist1、Snail1表达的影响 与空白组相比，白藜芦醇组、5-FU 组以及联合组细胞中Twist1、Snail1蛋白含量逐渐降低。见图5。

图5 白藜芦醇、5-FU以及联合使用对HeLa细胞Twist1、Snail1蛋白表达的影响

3 讨 论

已有研究发现多种因子和细胞均可通过促进宫颈癌细胞EMT，诱导宫颈癌细胞转移[16-19]。抑制宫颈癌细胞EMT已经在基础和临床实验中成为抑制宫颈癌细胞发生转移的主要药物作用靶点。因此，开发挖掘有效治疗EMT的药物及其策略成为抑制肿瘤转移的主要研究方向。联合用药在基础实验和临床研究中表现出良好的治疗肿瘤复发转移的效果和前景。本研究将传统的肿瘤治疗药物5-FU与天然抗氧化药物白藜芦醇联合使用在体外探索联合用药对宫颈癌细胞转移的影响，并基于EMT初步探索抑制转移的机制，为宫颈癌转移治疗提供基础参考。

本研究首先通过对白藜芦醇、5-FU以及联合用药抑制HeLa细胞的增殖情况进行检测，MTT结果显示联合用药的IC50明显低于单独用药，其中单独用药时白藜芦醇的IC50为61.42 μmol/L，5-FU的IC50为26.13 μmol/L，联合白藜芦醇时，5-FU的IC50为18.75 μmol/L。以上提示与白藜芦醇的联合使用提高了HeLa细胞对5-FU毒性的敏感性。经过Transwell小室迁移实验发现联合用药对HeLa细胞迁移的抑制能力明显高于单独使用白藜芦醇和5-FU。联合用药对肿瘤迁移抑制能力的增加是否是通过提高对EMT的抑制实现的，本研究在分子水平上进一步发现与单独用药相比，尽管单独用药同样降低了细胞中Vimentin、N-cadherin以及MMP-2、MMP-9的表达，提高了E-cadherin蛋白表达，但联合用药却更加明显降低了HeLa细胞中Vimentin、N-cadherin以及MMP-2、MMP-9蛋白的表达，提高了E-cadherin蛋白表达。E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白变化与EMT直接相关，其中E-cadherin、N-cadherin是维持细胞间连接的重要蛋白，Vimentin是维持细胞形态，参与细胞有丝分裂、分化的重要骨架蛋白[20-21]。在肿瘤分子生物学层面上，在多数上皮来源的恶性肿瘤中，E-cadherin表达下降，N-cadherin、Vimentin表达上升是细胞发生EMT的重要标志[22]。而在E-cadherin与Vimentin蛋白发生变化的时候，促进细胞转移的重要蛋白MMPs因受到E-cadherin的抑制或Vimentin的促进从而发生相应的表达变化[23]。在EMT过程中，Twist1、Snail1是调节EMT的重要转录因子。二者可识别E-cadherin基因启动子上的特殊序列，抑制E-cadherin的表达，从而启动EMT[24]。本研究发现联合用药可更加明显地抑制Twist1、Snail1的蛋白含量，提示联合用药相比于单独用药对HeLa细胞EMT具有更强的抑制逆转能力。

综上可知，相比于单独用药，白藜芦醇和5-FU的联合用药可降低5-FU的IC50，增强HeLa细胞对5-FU的敏感性，进一步探索发现联合用药导致5-FU在较低浓度下具有较高的肿瘤转移抑制能力，在分子层面上这种较高的转移抑制能力是基于对宫颈癌细胞EMT的更强抑制和逆转实现的，这在临床上有助于提高5-FU疗效，同时降低肿瘤耐药性和复发转移率，减轻5-FU的副作用。