董 萍，姜立波

(1.舟山市妇幼保健院耳鼻喉科，浙江 舟山 316100；2.舟山市定海区中心医院耳鼻喉科，浙江 舟山 316000)

分泌性中耳炎(secretory otitis media，SOM)是儿童常见多发病，以鼓室积液及听力下降为主要临床特征，常并发于腺样体肥大。因早期症状不明显、幼儿不善表达等因素，常发生延误就医、漏诊情况，致患儿错过最佳治疗时期，可能导致患儿出现听力不可逆下降或致聋，影响患儿的言语及智力发育，严重危害患儿的生命健康[1-2]。分泌性中耳炎的发病机制尚未明确，有研究发现，免疫因素可能与其发病相关[3]。腺样体属于鼻咽部淋巴组织的重要组成部分之一，其内含有大量不同发育阶段的淋巴细胞和炎症细胞因子，具有较强的免疫调节功能[4-5]。本研究通过比较腺样体肥大伴SOM患儿及单纯腺样体肥大患儿腺样体组织中的T淋巴细胞及炎症细胞因子的表达情况，探讨腺样体分泌的T淋巴细胞及炎症细胞因子与SOM发病的相关性，具体报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料

选取2015年3月至2018年2月期间舟山市妇幼保健院和舟山市定海区中心医院收治的单纯腺样体肥大患儿65例作为对照组，腺样体肥大伴SOM患儿70例作为观察组，所有研究对象的监护人均知情同意参与本研究。所有患儿均经鼻咽部X线侧位片、CT检查或纤维鼻咽内镜检查等证实为腺样体肥大，并行腺样体切除术取腺样体组织标本留样，腺样体肥大诊断标准参照增殖腺/鼻咽腔比率(A/N比率)测定方法，以A/N比率≥0.7显示为病理性肥大[6]，SOM以鼓室声导抗图为B型、C型或As型，CT检查鼓室积液阳性为诊断标准[7]。其中，对照组患儿男34例，女31例；年龄2～13岁，平均(7.9±2.4)岁；病程2～36月，平均(26.4±9.5)个月。观察组患儿男37例，女33例；年龄3～14岁，平均(8.4±3.1)岁；病程3～32月，平均(28.2±10.0)个月。入组患儿均排除腺样体机械性阻塞、鼻炎及支气管哮喘、急性呼吸道感染、自身免疫性疾病及糖皮质激素用药史等因素，临床均表现为睡眠打鼾、睡眠不安、张口呼吸、听力减退及耳鸣等。两组患儿的性别、年龄、病程等一般资料比较，差异无统计学意义(均P>0.05)，具有可比性。

1.2免疫组化法检测

采用免疫组化法分别检测两组患儿腺样体组织中CD3+、CD4+、CD8+T细胞的阳性表达量及CD4+T/CD8+T值。鼠抗人CD3、CD4、CD8单克隆抗体，SP试剂盒，DAB显色液均购自于北京中杉金桥生物技术有限公司。取留样组织标本置10%福尔马林溶液固定，常规石蜡包埋。免疫组化采用SP法，石蜡标本行5μm厚连续切片，常规脱蜡、梯度酒精水化；以3%H2O2室温孵育10～20min去除内源性过氧化物酶活性；以0.01mol/L的构椽酸盐缓冲液(pH=6)微波3档加热5min，行抗原修复；室温冷却后，以0.01mol/L PBS冲洗5min×3次；以5%BSA液37℃恒温封闭30min；加入1:80稀释的一抗，4℃孵育过夜。次日以PBS冲洗5min×3次，加入1:100稀释的山羊抗兔IgG二抗工作液，37℃恒温孵育20min，再以PBS冲洗5min×3次，加入1:100稀释的辣根酶标记链酶卵白素工作液，37℃恒温孵育20min，PBS冲洗5min×3次；DAB显色，苏木素复染，常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。以PBS溶液代替一抗作为阴性对照，以已知阳性高表达组织切片作为阳性对照。

CD3+、CD4+、CD8+T细胞均以胞膜或胞浆出现棕黄色颗粒为阳性，先在低倍视野(×100倍)下观察免疫组化切片，选取细胞均匀分布视野，再随机选取5个具有代表意义的高倍视野(×400倍)，以Image-pro plus6.0彩色图像分析系统进行分析，分别计数视野中的阳性细胞数，以平均阳性细胞数占总细胞数的百分率反映CD3+、CD4+、CD8+T细胞的阳性表达量。

1.3 ELISA法检测

采用ELISA法分别检测两组患儿腺样体组织中TNF-α、IL-2、IL-6的含量。人TNF-α、IL-2、IL-6的ELISA试剂盒均购于上海纪宁实业有限公司，应用双抗体夹心法进行检测，检测方法参照试剂盒说明书。

1.4统计学方法

2结果

2.1两组T淋巴细胞阳性表达量的比较

CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞在观察组和对照组患儿的腺样体组织中均有大量表达，表达多集中于细胞膜或包浆中，显色为棕黄色。与对照组患儿相比，观察组患儿腺样体组织中的CD3+、CD4+、CD8+T细胞的阳性表达量及CD4+T/CD8+T值均显著升高，两组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 两组T淋巴细胞阳性表达量的比较

2.2两组TNF-α、IL-2、IL-6含量的比较

与对照组患儿相比，观察组患儿腺样体组织中TNF-α、IL-2、IL-6的含量均显著升高，两组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

组别 例数(n)TNF-α(ng/L)IL-2(ng/L)IL-6(ng/L)对照组65108.62±11.23172.21±20.35126.34±13.95观察组70146.53±18.54215.54±22.48167.86±24.74t7.2818.0357.148P<0.05<0.05<0.05

3讨论

3.1儿童SOM伴发腺样体肥大的原因分析

分泌性中耳炎好发于儿童，研究发现，反复上呼吸道感染、扁桃体发炎、鼻窦发炎、咽鼓管功能障碍及免疫功能失调均可能引起分泌性中耳炎的发作[8-9]。由于儿童SOM发作常伴发腺样体肥大，我们分析，其一，可能是因为肥大的腺样体可直接压迫咽鼓管咽口，使咽鼓管出现通气功能障碍，减少耳内空气流通，形成负压，从而导致鼓室内出现积液[10]；其二，腺样体内含有大量的淋巴细胞和炎症细胞因子，腺样体肥大易导致腺样体局部出现免疫功能失调，进而诱发分泌性中耳炎[1]。

3.2 T淋巴细胞与SOM伴发腺样体肥大的相关性

淋巴细胞是反应细胞免疫的重要细胞群，可通过检测其中T淋巴细胞亚群的水平变化对机体的免疫功能进行监测[11]，其中，CD3+和CD4+分别代表T淋巴细胞和辅助性T淋巴细胞，二者协同调节免疫应答，具有增强机体免疫应答的作用，CD8+则代表抑制性T淋巴细胞，具有抑制机体免疫应答和T细胞增殖的作用，CD4+与CD8+相互拮抗，共同维持免疫功能的动态平衡[11]。众多学者一致认为，CD4+T/CD8+T可作为衡量患者免疫功能状态的一个重要指标，CD4+T/CD8+T值升高，显示机体免疫功能增强，CD4+T/CD8+T值下降，则显示机体免疫功能下降[12]。尽管腺样体的免疫功能近年来愈发受到重视，但腺样体中的免疫活性物质与SOM发病的相关性，仍有待进一步验证。本研究比较了腺样体肥大伴SOM患儿及单纯腺样体肥大患儿腺样体组织中的CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞的表达情况和CD4+T/CD8+T值，结果显示，腺样体肥大伴SOM患儿腺样体组织中CD3+、CD4+、CD8+T细胞的阳性表达量、CD4+T/CD8+T值均显著高于单纯腺样体肥大患儿(P<0.05)，可见，上述T淋巴细胞亚群均可能参与了分泌性中耳炎的发生、发展过程，该结果与Kotowski等[13]和马桂琴等[4]的报道基本一致。

3.3炎症细胞因子与SOM伴发腺样体肥大的相关性

腺样体组织肥大能够导致气道堵塞，诱发机体组织细胞缺氧，进而刺激释放大量TNF-α、IL-2、IL-6等多种炎症细胞因子，其水平的异常变化可影响机体的免疫和防御功能，介导机体发生变态反应，导致渗出性中耳炎(OME)患儿病情反复，经久不愈[14-15]，其中，IL-6具有促进B淋巴细胞生长、分泌免疫球蛋白作用，能参与早期OME防御反应[16]。本研究比较了腺样体肥大伴SOM患儿及单纯腺样体肥大患儿腺样体组织中TNF-α、IL-2、IL-6炎症细胞因子的表达情况，结果显示，腺样体肥大伴SOM患儿腺样体组织中TNF-α、IL-2、IL-6的含量均显著高于单纯腺样体肥大患儿(P<0.05)，可见，上述炎症细胞因子的大量释放也可能是分泌性中耳炎反复发作的机制之一，该结果与白治田等[17]和刘卫卫等[18]的报道基本一致。

终上所述，腺样体肥大伴SOM患儿腺样体局部T淋巴细胞及炎症细胞因子的表达均显著上升，可能诱导腺样体局部免疫功能失调，进而诱发SOM反复发作。