李春香，蒋 蒨，吴 华，刘俊敏，李 杰

(重庆科瑞制药(集团)有限公司，重庆 400060)

随着人们生活方式的改变，2型糖尿病发病率呈明显上升趋势。糖尿病及其并发症严重影响患者的生活质量[1]。二甲双胍片对血糖水平起到调节作用，在降低患者血糖水平的基础上，能够起到规避低血糖风险的作用，调节效果较好[2]。盐酸二甲双胍片含量测定UV法已被《中国药典》2015年版二部收录[3]，高效液相色谱法相较于UV法具有准确度高、回收率好等优点[4-7]。由于盐酸二甲双胍片规格较大(一般为0.25g、0.5g)，在其片剂含量测定时，采用液相色谱法常规进样量10μL或20μL，需要样品溶液配制时进行二次或多次稀释至50μg/mL以下[4-7]，增加的多次配制步骤降低了工作效率和测试结果准确度。本方法采用提高样品溶液进样浓度(140.36～421.08μg/mL)技术方案，取消溶液二次稀释过程，降低进样量至5μL，既防止了二甲双胍进样量的过载，又获得了较佳的色谱峰型和较高的样品含量检测准确度。结果表明，本研究建立的方法专属性及适用性强，试验效率更高，结果准确。

1 仪器与试剂

Agilent 1260 Infinity Ⅱ型高效液相色谱仪，紫外吸收检测器(安捷伦科技有限公司)；电子分析天平( Mettler Toledo 公司 XS105、XPE205)； pH计(Mettler Toledo 公司S210型)。

磷酸二氢钠(成都市科隆化学品有限公司)；戊烷磺酸钠(天津市复兴精细化工研究院)；磷酸(成都市科龙化工试剂厂)； 乙腈(Honeywell)；盐酸二甲双胍对照品：(中国药品食品检定研究院 批号100664-201604，纯度100%)；盐酸二甲双胍片仿制制剂(规格0.25g，重庆科瑞制药集团有限公司，批号20171101、20171102、20171103)；盐酸二甲双胍片参比制剂(规格0.25g 日本新药株式会社，批号355701、356202、356402、357901)；盐酸二甲双胍原料药(山东科源制药有限公司，批号P031-1708012 纯度99.68%)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters Symmetry C18(4.6×250mm，5μm)；流动相：0.005 mol/L磷酸二氢钠与0.01mol/L戊烷磺酸钠溶液(用磷酸调节pH值至3.0± 0.05)-乙腈(94∶6)；柱温：30℃；流速 1.0mL/min；进样量：5μL；检测波长：233 nm。

2.2 溶液制备

2.2.1 供试品溶液的制备

取盐酸二甲双胍片20片，用研钵研细，精密称定细粉适量(相当于盐酸二甲双胍28mg)，置于100mL容量瓶中，加水适量，超声处理10min，放置至室温，加水稀释至刻度，制成每1mL含0.28mg盐酸二甲双胍的溶液，摇均匀，滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.2 对照品溶液的制备

精密称取经105℃干燥2h的盐酸二甲双胍对照品28mg，置100mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，制成每1mL含0.28mg的溶液，摇均匀，即得。

2.2.3 空白辅料溶液制备

取盐酸二甲双胍片空白混合辅料(按处方配比)约15mg，置200mL量瓶加水适量，超声处理10min，放置至室温，加水定容至刻度，摇均匀，滤膜过滤，取续滤液作为空白辅料溶液。

2.3 专属性试验

取2.2制备的对照品、供试品、空白辅料溶液及空白溶剂-水四种溶液，在上述相同液相色谱条件下，进样量5μL，分别进行测定，记录图谱结果如图1，从图中可以看出空白溶剂-水、空白辅料均在主峰位置处不出峰，对盐酸二甲双胍含量测定无干扰。对照品和供试品图谱中盐酸二甲双胍保留时间为8.167min，色谱峰峰形尖锐对称，柱效较高，可见该方法专属性强。

A-空白溶剂-水；B-空白辅料溶液；C-对照品；D-供试品

图1 HPLC 色谱图

2.4 线性关系考察

取盐酸二甲双胍对照品适量，精密称定，加水超声溶解并稀释至刻度，制成每1mL中约含2.8mg的溶液作为对照品贮备液；分别精密量取对照品贮备液适量，置容量瓶中，加水定容至刻度，摇均匀，同样方法得到相当于对照品0.28mg/mL浓度的50%、80%、100%、120%、150%系列线性溶液(即浓度分别为140.36μg/mL、224.58μg/mL、280.72μg/mL、336.86μg/mL、421.08μg/mL)，精密量取各线性溶液5μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。以峰面积对浓度进行线性回归计算，并计算响应因子(A/C)。以浓度 C(μg/mL)为横坐标，峰面积A为纵坐标，进行线性回归，得出线性方程为：A=17.203C+37.413，r=1.000，线性回归直线的截距相当于限度浓度响应值的0.77%，各浓度的响应因子相对偏差RSD为0.34%(n=5)，可以看出在140.36～421.08μg/mL的浓度范围内盐酸二甲双胍的浓度与其峰响应值呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验

精密量取“2.2.2”中对照品溶液5μL，在相同色谱条件下注入液相色谱仪，重复进样6次，记录盐酸二甲双胍峰保留时间和峰面积，经计算6次进样所得二甲双胍峰保留时间和峰面积的相对标准偏差 RSD分别为0.02%和0.12%，小于标准规定和文献报道[3，6]，按盐酸二甲双胍峰面积计算得出的理论塔板数大于1.5万，说明本方法精密度良好。

2.6 重复性

按照“2.2.1”与“2.2.2”溶液的配置方法，采用相同色谱条件进行测试，分别考察不同实验人员使用不同液相色谱仪对本方法的影响。进样量均为5μL，每组试验采集6份样品的色谱图。按外标法以盐酸二甲双胍峰面积计算2组试验(12份样品)的平均含量为100.7%，RSD为0.86%，说明本方法具有较好的重复性。

2.7 回收率试验

供试品溶液的制备：精密称取原料药(按照处方比例盐酸二甲双胍含量100%计算，分别称取处方比例含量的0.8倍、1倍与1.2倍各三份，分别记作低浓度、中浓度、高浓度)与空白混合辅料(按配方混合均匀)置同一100mL量瓶中，加入适量水，超声溶解之后加水稀释定容至刻度，滤膜过滤，取滤液作为供试品溶液。对照品溶液取“2.2.2”中溶液。由测得量和加入量计算回收率，结果如表1。

表1 回收率试验结果(n=9)

由表1结果可知，三种不同含量的样品(分别为处方比例含量的0.8倍、1倍与1.2倍)共9组试验，不同浓度样品测定回收率分别为98.62%、98.99%和99.71%，总平均回收率为99.10%，RSD为0.54%，表明利用方法测定盐酸二甲双胍片含量回收率较好，准确度较高。

2.8 溶液稳定性

取“2.2.1”与“2.2.2”中溶液，在常温条件下放置0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、16h、20h、24h后分别精密量取5μL注入液相色谱仪，测定峰面积与保留时间。供试品和对照品溶液放置24h，盐酸二甲双胍测得的峰面积经计算其RSD分别为1.24%和1.20%，保留时间RSD分别为0.13%和0.12%，表明此方法配置的供试品溶液和对照品溶液在24h内能够稳定。

2.9 样品测定

照“2.2.1”与“2.2.2”配制3批仿制制剂与4批参比制剂，取上述两种溶液各5μL注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以盐酸二甲双胍峰面积计算含量。结果3批仿制制剂(批号20171101、20171102、20171103)和4批参比制剂(批号355701、356202、356402、357901)盐酸二甲双胍含量分别为101.1%、102.6%、101.6%、101.5%、101.6%、99.2%、102.3%；RSD分别为0.22%、0.50%、0.62%、1.13%、0.42%、0.75%、0.31%。

3 讨论

检测波长确定：用配制好的供试品溶液和对照品溶液在200～400nm范围内扫描，对照品和供试品溶液在233nm处有最大吸收峰，对比溶剂-水和辅料对测试峰无干扰，故将检测波长定为233nm。

流动相选择：通过多种试剂的比较和选择，本方法制备的0.005 mol/L磷酸二氢钠与0.01mol/L戊烷磺酸钠流动相溶液(用磷酸调节pH值至3.0± 0.05)-乙腈(94∶6)排除了溶剂和辅料等物质对测试结果的干扰。所测样品理论塔板数大于1.5万(按盐酸二甲双胍峰计算)，基线平稳且图谱峰型对称性较好，最大峰值保留时间为8.167min，说明该技术方案样品含量测定分离效果较好。

原国家注册标准中的盐酸二甲双胍含量测定方法由试验证明回收率较低，影响了盐酸二甲双胍药品生产过程各工序药品含量折算准确度[8]。故本研究采取超声溶解提高样品溶液浓度(140.36～421.08μg/mL)和减少进样量(5μL)的技术方案，取消了大规格样品溶液配制多次稀释溶解过程，减少了多次稀释操作等过程人为因素对盐酸二甲双胍片含量测定准确度影响。在盐酸二甲双胍片生产过程产品控制与成品检验中，经优化了的HPLC盐酸二甲双胍含量测定方法样品回收率达到了99.10%，RSD为0.54%，与理论投料量具有高度的吻合性。经过方法学考察，表明该方法专属性强，准确灵敏，重复性好，有效的提高了盐酸二甲双胍片含量测定的质量控制准确性。