肖中元，彭 力，李玉林，程永刚

(太极集团西南药业股份有限公司，重庆 400038)

辅酶Q10(Coenzyme Q10、Ubidecarenone)具有调节免疫、抗氧化、延缓衰老等功能[1]。辅酶Q10剂型开发比较全面，包括片、胶囊、注射液、软胶囊。辅酶Q10已在全球主要国家上市，包括美国、欧洲、日本等。辅酶Q10标准已列入《中国药典》、《美国药典》和《欧洲药典》，并且都收载了异构体检测项目对异构体含量进行控制，对比三种异构体检测方法，发现色谱条件及样品处理方法各药典要求基本一致[2]。现国内、国外主流药典标准中都没有对辅酶Q10氯化钠注射液的异构体进行检测与控制。固相萃取(SPE)是利用固定相吸附样品中的目标化合物，分离样品的基体和干扰化合物，达到分离和富集目标化合物的目的。固相萃取作为样品前处理技术[3]，在实验室中得到了越来越广泛的应用[4-6]。本文通过使用固相萃取进行样品的前处理，除去辅酶Q10氯化钠注射液中的辅料，富集辅酶Q10及异构体成分，并使用HPLC分析方法，建立了一种辅酶Q10氯化钠注射液异构体检测方法。

1 仪器与试药

岛津LC-20AT液相色谱数据工作站( 包括四元泵、真空在线脱气机、自动进样器、柱温箱、PDA检测器及LabSolutions色谱工作站) ；XS205DU电子分析天平(METTLER TOLEDO)；PL203电子天平(METTLER TOLEDO)；ARIUM 611UF超纯水制备仪(Sartorius)；HP-Silica色谱柱(250×4.6mm，5μm；Sepax)；CNWBOND LC-C18 SPE TUBES(500mg，3ml；CNW Technologies)。

正己烷(色谱级，天津市福晨化学试剂厂)；异丙醇(色谱级，天津市光福精细化工研究所)；甲醇(色谱级，TEDIA)；辅酶Q10系统适应性对照品(USP REFERENCE STANDARD LOT:F0B194 USP ROCKVILLE,MD)；辅酶Q10对照品(批号140611-201204，含量99.7%，中国食品药品检定研究院)。

2 实验方法与结果

2.1 色谱条件

采用HP-Silica色谱柱(250×4.6mm，5μm)；以正己烷-乙酸乙酯(97∶3)为流动相；流速为每分钟1.0mL；柱温35℃；检测波长为275nm；进样体积100μL。

2.2 溶剂

以异丙醇-正己烷(1∶9)为溶剂。

2.3 溶液制备

2.3.1 供试品溶液的制备

避光操作。取预处理柱(LC-C18)一支，先用3mL甲醇活化预柱，再用3mL纯水清洗预柱。取本品25mL，以约2mL/min速度，通过预柱。先用3mL纯水清洗预柱，再用1mL甲醇冲洗并快速通过预柱，抽干。再用0.5mL异丙醇冲洗，最后用4.0mL正己烷冲洗，将异丙醇和正己烷清洗液收集于同一5mL量瓶中，加正己烷至刻度，摇匀，即得。

2.3.2 对照溶液的制备

精密量取供试品溶液1mL，置100mL量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得(临用新制)。

2.3.3 对照品储备液

精密称取辅酶Q10对照品(99.7%)10.30mg，至10mL量瓶中，用溶剂溶解稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3.4 对照品溶液

精密吸取对照品储备液适量，用溶剂稀释制成2.054μg/mL的溶液，摇匀，即得。

2.3.5 系统适应性溶液

精密称取辅酶Q10系统适应性对照品 10mg，用溶剂溶解稀释至10mL，摇匀，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 方法专属性

取系统适应性溶液、供试品溶液、溶剂与阴性对照溶液测定(图1)。结果表明，供试品与系统适应性溶液色谱中辅酶Q10异构体峰保留时间一致，而在相应位置阴性对照及溶剂无干扰；以辅酶Q10异构体峰计算，理论塔板数均大于18000，分离度不小于2.5，峰纯度符合要求，该方法专属性和系统适用性满足异构体含量测定要求。

1.异构体；2.辅酶Q10

图1 专属性HPLC色谱图

2.4.2 线性关系考察

精密量取对照品溶液5、10、15、20、40、50、60、75、100μL，注入高效液相色谱仪，依法测定。以对照品进样量( ng) 为横坐标，以辅酶Q10峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=911.019X-762.510，相关系数 r 为0．99997，表明进样量在10.3～205.4 ng范围内线性关系良好。

2.4.3 检测限与定量限

精密量取对照品溶液1μL、3μL，注入高效液相色谱仪，依法测定。检测限为2.054ng( S/N=3∶1)，为主成分进样量的0.02%；定量限为6.161ng(S/N=10∶1)，为主成分进样量的0.06%。

2.4.4 准确度

2.4.4.1 测定方法回收率

分别精密吸取对照品储备液0.85mL、1.0mL、1.2mL至不同的10mL量瓶中，用溶剂稀释至刻度，制成低、中、高浓度供试品溶液，各3份，分别进样100μL。计算辅酶Q10回收率(见表1)。回收率均在98.4%～100.3%之间，平均回收率为99.5%，回收率RSD为0.8%(n=9)，小于2.0%。结果表明该方法准确度良好，能够用于样品异构体含量测定。

表1 测定方法的回收率结果

2.4.4.2 固相萃取回收率

精密称取辅酶Q10原料6.6mg至50mL量瓶中，用正己烷溶解稀释至刻度，进样100μL，计算辅酶Q10原料中异构体含量；精密称取辅酶Q10原料22.5mg，按照样品生产工艺处方配置成1000mL样品，分别各取20mL、25mL、30mL通过固相萃取，制成低、中、高不同异构体和辅酶Q10量的供试品溶液，各3份，分别进样100μL。采用外标法测定辅酶Q10含量，计算回收率。假定异构体无损失，则异构体理论量=原料异构体含量/对应辅酶Q10回收率。辅酶Q10萃取回收率(见表2)均在86.0%～89.6%之间，平均回收率为87.3%，RSD为1.37%(n=9)，小于2.0%；异构体萃取回收率(见表3)均在101.9%～107.9%之间，平均回收率为105.7%，RSD为1.8%(n=9)，小于5.0%。

表2 固相萃取后样品辅酶Q10回收率

表3 固相萃取后样品辅酶Q10异构体回收率结果

2.4.5 精密度试验

2.4.5.1 重复性试验

取同一批辅酶Q10氯化钠注射液供试品，按供试品溶液和对照溶液的制备方法平行制备6 份供试品溶液和对照溶液，精密量取100μL，注入高效液相色谱仪，依法测定，以测得的供试品中异构体含量计，RSD 为0. 9%(n=6)，表明该方法重复性良好。

2.4.5.2 中间精密度试验

取同一批辅酶Q10氯化钠注射液供试品，在不同时间及不同人员变动因素下实验，按供试品溶液和对照溶液的制备方法制备供试品溶液和对照溶液，考察中间精密度。以测得的供试品中异构体含量计，中间精密度RSD 值为1.8%(n=12)，表明该方法中间精密度良好。

2.4.6 溶液稳定性试验

按照供试品溶液和对照溶液的制备方法制备供试品溶液和对照溶液，置于避光25℃环境下保存，分别于制备后0、1、3、5和7 h依法进样检测，以测得的辅酶Q10异构体含量计，RSD 为1.3%(n=5)，表明供试品溶液在7 h 内稳定。

2.4.7 色谱条件耐用性考察

按照供试品溶液和对照溶液的制备方法制备供试品溶液和对照溶液，在流动相比例(±1%)、流速(±0.1mL/min)、波长(±2nm)、柱温(±5℃)等色谱条件微小变化下，系统适应性试验辅酶Q10与异构体的分离度均大于2.9，异构体含量测定结果无显著差异，RSD均小于2.0%(n=6)。因此，该方法耐用性良好，色谱条件微小变化对异构体含量测定结果无影响。

3 小结

综上所述，本文采用 SPE-HPLC 联用技术，以SPE 技术除去辅料并富集样品中辅酶Q10及异构体，为辅酶Q10氯化钠注射液中异构体的质量控制提供了可靠的技术手段。