李爱琳，蒋志宏，蔡 鸣，宋冬冬，马 强（通讯作者）

（大连大学附属中山医院神经内科 辽宁 大连 116000）

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一个连续发病过程，分为临床前期、轻度认知障碍（MCI）和痴呆三个阶段。2011年NIA-AA的AD诊断标准将MCI作为AD病程进展的早期阶段[1]，表现为轻度记忆和认知功能障碍，但一般生活能力没有显著影响。轻度认知障碍主要包括遗忘型轻度认知障碍（aMCI）和非遗忘型轻度认知障碍两种形式，其中以记忆力减退为主的aMCI是AD的高风险组，最常转化为AD，因此aMCI时期生物学标记物的选择对于AD早期预测、明确诊断、发展趋势判断具有重要临床意义。NIA-AA诊断标准指出脑脊液中Aβ-42联合T-tau或P-tau对于AD或MCI时期的临床诊断具有很大的灵敏性和特异性，但由于其有创性导致临床不易获得，因此从血液中发现具有预测性的生物标记物具有良好应用前景。Olsson[2]Meta分析发现，外周血Tau蛋白在鉴别AD组和正常对照组之间具有一定诊断价值。2018年韩国一项研究[3]为没有认知障碍的韩国成人建立外周血Aβ参考区间，以方便痴呆及痴呆前期患者临床筛查。然而，仅有外周血生物标记物还不足以对AD早期进行确切诊断。氢质子磁共振波谱（1H-MRS）作为非侵入性检查可测定脑神经生化物质水平，反映大脑神经元损失、神经胶质增生。本研究测定aMCI、AD、及健康对照三组血清中Aβ42和P-Tau蛋白水平，氢质子磁共振波谱对海马代谢物定量分析，分析二者是否具有相关性，探讨其能否成为预测aMCI向AD转化的可能性生物标记物。

1 资料与方法

1.1 一般资料

根据临床医师诊断选取年龄范围60～80岁之间的120例老年患者，将其分为三组：遗忘型轻度认知障碍（aMCI）组、阿尔茨海默病（AD）组和健康对照组。

1.1.1 入组标准（须同时符合以下所有条件）

（1）aMCI组

①符合2011年NIA-AA临床研究MCI诊断标准；

②内侧颞叶萎缩视觉评定量表（MTA-scale）评分Ⅰ～Ⅱ级。

（2）AD组

①符合2011年NIA-AA阿尔茨海默病诊断标准；

②内侧颞叶萎缩视觉评定量表（MTA-scale）评分Ⅲ～Ⅳ级。

（3）健康对照组

①年龄、性别和受教育程度与其他两组相匹配；

②MMSE评分≥28分，MoCA评分≥26分，CDR评分=0分；③内侧颞叶萎缩视觉评定量表（MTA-scale）评分0级；④无明显记忆力下降。

1.1.2 排除标准（符合下列任一条件即排除）

（1）既往颅内出血或缺血性疾病并伴有神经系统局灶性体征，影像证据支持脑小血管疾病（Fazekas分值≥2分）。

（2）患有其他可能引起脑功能损害的神经系统疾病（如癫痫、抑郁、颅内肿瘤、帕金森病、代谢性疾病、脑炎、多发性硬化、脑外伤、正常颅压脑积水等）

（3）患其他系统性疾病所致认知障碍：如肝功能不全、肾功能不全、甲状腺功能障碍、严重贫血、叶酸和维生素B12缺乏、CO中毒、特殊感染（如梅毒、艾滋病）、酒精和药物滥用等。

（4）存在精神和神经发育迟滞。

（5）存在其他可能导致认知功能障碍的疾病。

（6）存在核磁共振检查禁忌症。

（7）罹患无法配合完成认知检查的疾病。

（8）拒绝抽血。

（9）参与者拒绝签署书面知情同意书参与研究。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 血液标本采集：早晨空腹采集血液，每个受试者采集3ml血清

1.2.2 标本检测 采用双抗体夹心酶联免疫吸附实验法（EIISA）测定血清中P-Tau蛋白和Aβ42蛋白含量；实验测定全程按照试剂盒要求进行，获得标准管水平和吸光度，建立标准曲线，并基于吸光度计算P-Tau蛋白和Aβ42水平。

1.3 影像学检查

采用德国西门子3.0T Verio超导磁共振扫描仪，12通道标准头颅线圈，对所有患者行1H-MRS成像。MRI扫描仪直接完成基线校准、平均信号、识别代谢物、计算代谢物N-乙酰天门冬氨酸（NAA）、肌醇（Cho）、肌酸（Cr）峰值下面积和Cho/Cr、NAA/Cr比值。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 方差分析比较三组间血清P-Tau蛋白水平差异有统计学意义（P＜0.05），AD组P-Tau蛋白高于aMCI和对照组；两两比较：健康对照组与aMCI组间差异无统计学意义（P＞0.05），健康对照组和AD组、aMCI与AD组间差异有统计学意义（P＜0.05）。三组间血清Aβ42蛋白水平差异有统计学意义（P＜0.05），AD组低于aMCI组与对照组（表2）；两两比较：健康对照和aMCI组、aMCI和AD组间差异无统计学意义（P＞0.05），健康对照与AD组间差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 实验对象基本信息比较（±s）Tab.1 Comparison of basic information of experimental subjects（±s）

表1 实验对象基本信息比较（±s）Tab.1 Comparison of basic information of experimental subjects（±s）

组别 n 年龄 性别（男/女） M M S E M o C A a M C I 组 3 3 6 7.7 0±1 0.2 4 1 2/2 1 2 4.2 7±4.4 3 2 0.0 3±5.0 5 A D 组 3 8 7 5.5 3±1 0.0 7 2 0/1 8 1 1.7 9±9.3 6 8.4 7±7.3 2健康对照组 4 9 6 6.6 7±8.1 3 2 3/2 6 2 8.6 3±1.3 4 2 7.0 2±2.7 0

表2 aMCI组与AD组、健康对照组血清P-Tau蛋白及Aβ42浓度的比较（±s，ng/L）Tab.2 Comparison of serum P-Tau protein and Aβ42 concentration in aMCI group,AD group and health control group（±s,ng/L）

表2 aMCI组与AD组、健康对照组血清P-Tau蛋白及Aβ42浓度的比较（±s，ng/L）Tab.2 Comparison of serum P-Tau protein and Aβ42 concentration in aMCI group,AD group and health control group（±s,ng/L）

组别 n P-Tau蛋白浓度 Aβ1-42浓度AD 组 38 100.6437±39.6949 95.2184±41.5743 aMCI 组 33 79.0206±36.8435 101.3365±71.0674健康对照组 49 77.0538±36.5610 124.7918±59.7044 t-4.786 3.152 P-＜0.05 ＜0.05

表3 海马区磁共振波谱代谢物水平（±s）Tab.3 Levels of MRS metabolites in the hippocampus(±s)

表3 海马区磁共振波谱代谢物水平（±s）Tab.3 Levels of MRS metabolites in the hippocampus(±s)

左侧海马Cho Cr NAA Cho Cr NAA aMCI 组 8.54±1.85 8.10±1.59 9.45±2.08 9.30±2.48 9.08±2.26 10.39±2.60 AD 组 7.86±2.75 7.64±2.18 7.82±2.30 7.57±2.20 8.08±2.18 8.61±2.60健康对照组 8.95±2.4 8.11±2.06 10.33±2.53 9.98±2.60 9.51±2.20 11.50±3.13 t 1.911 0.774 10.447 8.723 3.722 9.361 P 0.153 0.464 0.000 0.000 0.027 0.000组别 右侧海马

表3 海马区磁共振波谱代谢物水平附表（±s）Tab.3 Levels of MRS metabolites in the hippocampus(±s)

表3 海马区磁共振波谱代谢物水平附表（±s）Tab.3 Levels of MRS metabolites in the hippocampus(±s)

左侧海马NAA/Cr Cho/Cr NAA/Cr Cho/Cr aMCI组 1.16±0.21 1.05±0.22 1.17±0.26 1.04±0.24 AD组 1.08±0.35 1.04±0.33 1.10±0.34 0.96±0.25健康对照组 1.29±0.28 1.11±0.18 1.22±0.28 1.06±0.18 t 5.329 0.800 1.331 1.763 P 0.006 0.452 0.026 0.176组别 右侧海马

2.2 方差分析可见右侧海马NAA（t=10.447，P＜0.05）、NAA/Cr（t=5.329，P＜0.05），左侧海马Cho（t=8.723，P＜0.05），Cr（t=3.722，P＜0.05），NAA（F=9.361，P＜0.05）、NAA/Cr（t=1.311，P＜0.05）差异具有统计学意义。三组双侧海马磁共振波谱测得代谢物水平随着病情变化各项数值均明显降低，其中双侧海马Cho/Cr比值、右侧Cho、Cr虽呈下降趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。不同物质相对含量峰下面积和统计分析结果见表3。

血清Aβ42、P-Tau蛋白与磁共振波谱检测数据进行相关性分析：Aβ42与双侧海马NAA、Cho、Cr具有相关性（P＜0.05 ），P-Tau与其未见明显相关。

2.3 磁共振波谱测量双侧海马代谢物Cho、Cr、NAA、NAA/Cr、Cho/Cr曲线下面积均在50%以上，具有诊断价值，其中双侧NAA、Cho、NAA/Cr诊断意义更大（表4）。P-Tau、Aβ-42的ROC曲线下面积分别为0.337，0.764，P-Tau曲线下面积小于0.5无诊断价值；Aβ42曲线下面积大于0.5存在诊断意义（表5）。

图1 磁共振波谱代谢物变化ROC曲线Fig.1 ROC curves of MRS metabolite change

表4 磁共振波谱代谢物约登指数、灵敏度、特异度和ROC曲线下面积Tab.4 MRS metabolites, index, sensitivity, specificity, and area under the ROC curve

图2 血清中P-Tau蛋白及Aβ42蛋白ROC曲线Fig.2 ROC curves of serum P-Tau protein and Aβ42 protein

表5 血清P-Tau、Aβ-42约登指数、灵敏度、特异度和ROC曲线下面积Table.5 Serum P-Tau, Aβ-42 Yoden index, sensitivity,specificity and area under the ROC curve

3 讨论

轻度认知障碍（MCI）是阿尔茨海默病（AD）的高危人群，MCI患AD的危险性是正常老年人的10倍[4]。根据认知域损伤部位不同，将MCI分为遗忘型MCI（aMCI）和非遗忘型MCI，aMCI主要具有与其年龄和教育程度不相符的情景记忆障碍，Wang[5]研究发现aMCI患者更容易转化成AD。Ball[6]指出，阿尔茨海默病主要是“海马痴呆”，海马是AD影响最早且最严重的效应区域，在AD患者海马区常出现神经细胞丢失和神经胶质增生。在MCI和AD时期都伴有包括海马在内的内侧颞叶萎缩，AD时期可较正常对照减少40%以上[7]，AD患者萎缩程度重于MCI患者[6]。内侧颞叶萎缩视觉评定量表（MTA-scale）对于内侧颞叶的萎缩具有很好的体现，对于MCI及AD的诊断也存在一定意义。2011年NAA-AA关于MCI诊断标准分为临床和科研两方面，后者实质上是AD源性MCI，必将转化为AD性痴呆，MCI临床诊断标准与Petersen诊断标准基本一致，由于MCI具有异质性，如何识别未来转化为AD性痴呆的MCI是目前研究热点，本研究选择海马萎缩MTAⅠ～Ⅱ级的aMCI患者，探讨外周血生物标记物水平与海马代谢物MRS分析相关性。

STRUYFS[8]对AD和健康对照人群脑脊液Aβ42蛋白比较，发现AD患者脑脊液Aβ42水平显著低于健康对照人群，在本研究中，血清中Aβ42水平成逐渐下降趋势，AD患者低于aMCI及健康对照，这与脑脊液结果一致。健康对照与AD组血清Aβ42水平差异存在统计学意义，既往研究发现，在未表现痴呆症状的老人中，Aβ42可作为发展为MCI或AD的独立危险因素。健康对照和aMCI组、aMCI和AD组血清中Aβ42差异无统计学意义，可能由于本研究样本量较小，部分患者存在由其他因素而导致继发性记忆力减退症状有关。

研究提示，相比较MCI和健康对照组，AD患者脑脊液P-Tau水平最高。本研究三组样本血清检测中，P-Tau水平随着认知障碍严重程度出现上升趋势，与脑脊液相同的趋势水平，这可能与神经原纤维缠结病理机制导致细胞破裂，胞内大量Tau蛋白外流有关。国内研究发现：AD组脑脊液中Tau蛋白浓度明显高于对照组，差异存在统计学意义，本研究结果显示AD组血清中P-Tau浓度与健康对照组间差异存在统计学意义；aMCI和AD组之间血清P-Tau蛋白水平差异存在统计学意义，提示血清P-Tau水平可作为aMCI向AD转化的预测因子；但在健康对照组和aMCI组血清P-Tau水平差异无统计学意义，提示在aMCI阶段外周血P-Tau还不足以反映AD病理改变[8]。

尽管脑脊液Aβ下降与P-Tau蛋白升高是AD的特异病理表现，在本研究中血清Aβ42与P-Tau也得到相同变化趋势，但是在MCI阶段缺少特异性，也可见于其他神经系统疾病。因此，仅靠外周血中检测到Aβ42、P-Tau水平变化不能准确筛查出AD源性MCI。MRS可发现颅内代谢物水平变化，反映神经元损伤，在AD及其早期脑结构改变前MRS即可定量检测出颅内代谢物变化。MRS有3个主要波峰：N-乙酰天门冬氨酸（NAA）在2.01ppm；胆碱（Cho）在3.22ppm；肌酸（Cr）在3.04ppm，NAA主要存在于中枢神经系统的神经元、轴突和树突，是判断神经元密度和活力的标志；Cr提示脑组织能量代谢水平，相对稳定，作为量化其他神经代谢物的“内部参考”；Cho细胞膜合成的标志物，细胞磷脂代谢成分之一。

ROC曲线是简单描述诊断测试的工具，ROC曲线下面积评估标记物的性能，即曲线下面积大于50%，表示具有诊断意义。本研究中血清Aβ42、P-Tau曲线下面积分别为76.4%、33.7%，波谱数据均大于50%，其中NAA、Cho、NAA/Cr曲线下面积更大，提示Aβ42和NAA、Cho、NAA/Cr对aMCI、AD更有诊断意义。

相关性分析显示三组受试者血清Aβ42与双侧海马NAA、Cho及Cr之间存在显著的相关性，可能与Aβ神经毒性作用于线粒体，损伤神经元功能间接造成NAA水平的降低相关。P-Tau和波谱代谢物之间无显著相关性。本研究三组P-Tau和波谱代谢物之间无显著相关性可能检测的是外周血P-Tau有关。

在AD发展不同阶段，AD相关的生物学标记物存在相应的变化。脑脊液中生物标记物虽然有特异性，但由于其有创性导致临床不易获得，因此，外周血生物标记物水平变化能否替代脑脊液成为近年来研究热点。本研究通过检测血清生物标记物Aβ、P-Tau水平，结合AD发生、发展过程最早易损害部位海马区域磁共振波普代谢物分析，血清Aβ42、P-Tau蛋白浓度变化在健康对照老年人、aMCI、AD患者三组间具有统计学意义，血清中A β42蛋白浓度变化与海马区磁共振波谱NAA、Cr、Cho具有相关性，也许外周血生物标记物结合磁共振波普分析能够用于AD源性MCI筛查。然而，本研究亦有不足。其一，样本量不够大，外周血生物标记检测值需要更多更好检测方法；其二，磁共振波普对脑代谢无水平分析仍有争议，故联合FDG-PET、PiB-PET、多模态磁共振成像特征或脑连接超网络等技术，可能发现更有价值的预测因子。故在今后关于aMCI患者外周血生物标记物研究中，扩大样本量，扩大研究视角，将对aMCI早期检测更有研究意义。