李观强 张娟娟 梁 娟 林士军 刘 智 李国保 曾常春 张国良

(深圳市龙岗区人民医院检验科,深圳518172)

肺结核(Pulmonary tuberculosis,PTB)，属于慢性传染病，病因为感染结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)，是传染病中引起人类死亡的首要原因，在全球范围内，2017年新增了1 000多万新发病例和160多万死亡病例[1]，严重危害全球人类健康。因此，找出与肺结核相关基因，快速确诊肺结核，对结核病的治疗有重要意义。

单核细胞在固有免疫和适应性免疫应答中发挥重要作用，在宿主Mtb感染防御中属于第一道防线[2]，单核细胞被激活后，可通过自噬、凋亡等多种机制将细胞内的Mtb有效清除[3,4]。

miRNAs是存在于真核生物中的内源性非编码RNA，长度约20～25个核苷酸，能对基因表达进行调节，进而对细胞的分化、增殖、凋亡及免疫应答等多环节产生影响[5]。有学者的相关研究显示在肺结核(PTB)、结核潜伏感染(Latent tuberculosis infection,LTBI)、健康捐献者(Healthy donor,HD)中miRNAs表达谱存在差异[6-9]。miR-17～92簇是一个典型的miRNA家族成员。在人类基因组中，miR-17～92簇编码6个miRNA，包括miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-110。其中，针对miR-20a在肿瘤发生发展过程中发挥的作用的相关研究较多，有报道指出，在甲状腺未分化癌中，其表达较高，并能促进胃癌细胞增殖，抑制细胞凋亡[10，11]。然而，在Mtb感染过程中，miR-20a是否发挥类似作用以及通过何种机制发挥作用仍然未知。因此，本研究重点探讨在结核菌感染过程中单核细胞miR-20a的表达变化情况及其与肺结核诊断、治疗的关系。

1 资料与方法

1.1临床资料 PTB人群来自深圳市第三人民医院，LTBI、HD人群则为到龙岗区人民医院呼吸科就诊者及自行体检者。PTB诊断标准：以《临床诊疗指南·结核病分册》(中华医学会，2005年)中的相关诊断要求为参考，符合肺结核的临床症状、体征，肺部阴影，痰涂片及结核菌特异性IFN-γ Elispot检测均为阳性，排除HBV、HCV、HIV、糖尿病等患者。LTBI人群：未见结核临床表现， IFN-γ Elispot检测阳性，无其他合并症。HD人群的PPD实验和IFN-γ Elispot均为阴性。经统计分析，最后入组PTB、LTBI、HD各5例。三组年龄、性别分布等基线资料接近，差异无统计学意义(P>0.05)。本研究符合医学伦理，经两院伦理委员会审核并获得批准，对象知情同意，本人签署有关证明文书。

1.2方法

1.2.1分选外周血CD14+单核细胞 采集5 ml研究对象外周血，使用肝素锂抗凝，分离PBMC(应用密度梯度离心法)，取PBMC(1×107个)以及5 μl CD14+免疫磁珠，均为德国Miltenyi公司生产，放入冰箱，4℃环境下孵育20 min后，应用MACS自动磁珠分选仪，将CD14+单核细胞分选出来。

1.2.2提取和测定总RNA 使用QIAGEN miR-Neasy Mini Kit 试剂盒，具体操作严格按照产品说明书进行，从每份样本中选取1×106个CD14+单核细胞以提取总RNA。使用美国Agilent公司生产的超微量分光光度计测定总RNA的浓度和质量，置入冰箱，在-80℃环境中长期保存。

1.2.3miRNA表达谱的基因芯片检测 miRNA芯片检测由深圳华大基因公司完成。按照丹麦Exiqon公司的miRCURY TM Hy3TM Power标记试剂盒说明书进行检测。先行miRNA的荧光标记，再与miRCURYTM LNA芯片(v.18.0)杂交。随后使用美国Axon公司的Axon GenePix 4000B芯片扫描仪对芯片的荧光强度进行扫描，使用聚类分析仪(Cluster 3.0)和树状视图分析法来分析数据。

1.2.4TaqMan qPCR验证miRNA的差异表达 根据miRNA芯片结果，在大样本人群中分别选取HD、LTBI、PTB各10例对具有明显差异表达的miRNA分子进行qPCR验证。RNA的反转录采用TaqManTMmiRNA cDNA 试剂盒完成，然后行qPCR扩增。具体反应体系： 10.0 μl TaqManTMmaster mix,1.0 μl miRNA引物，1.5 μl cDNA，7.5 μl RNase free H2O。反应条件：95℃，10 min；95℃，15 s，60℃，60 s，40个循环。以RNU6B作为内参，用2-ΔΔCt表示miRNA的相对表达量。

1.2.5TaqMan qPCR检测活动性肺结核患者抗结核药物治疗前后miRNA的差异表达 选取5例活动性肺结核患者，在抗结核药物治疗前及治疗3个月、6个月后分别采集患者外周血，采用密度梯度离心法分离PBMC，使用免疫磁珠从PBMC中分选出CD14+单核细胞，最后采用QIAGEN miR-Neasy Mini Kit 试剂盒提取CD14+单核细胞的总RNA进行TaqMan qPCR测定，分析miRNA的表达情况。

1.2.6体外验证实验 用H37Rv、H37Ra及BCG以MOI=10时分别感染分化的人单核细胞，37℃孵育，分别收集0、15、30、60、90、120、240、480 min时间点的细胞，裂解细胞，采用QIAGEN miR-Neasy Mini Kit 试剂盒提取细胞总RNA，miR-20a-5p的表达量通过qPCR进行检测。

2 结果

2.1三组CD14+单核细胞miRNA的表达谱对比 三组对象中各选5例，收集外周血分离PBMC，随后从PBMC中采用磁珠分选出CD14+单核细胞，再提取总RNA，进行miRNA的荧光标记后，将其与miRCURYTM LNA芯片的杂交,最后使用Axon GenePix 4000B芯片扫描仪对芯片的荧光强度进行扫描，使用Significance Analysis of Microarrys 软件进行聚类分析。结果发现，在三组人群miRNA表达谱中，miR-20a-5p的表达差异最显著，见图1。

2.2TaqMan qPCR验证miR-20a-5p的差异表达 为验证miRNA芯片结果的可靠性，在大样本的HD、LTBI、PTB三组人群中各选10例，总RNA样本采用TaqMan qPCR方法检测miR-20a-5p的差异表达。结果显示，miR-20a-5p在三组人群中的表达水平差异有统计学意义，其在活动性肺结核患者中的表达水平显著低于在HD和LTBI人群中的表达水平(P<0.05,P<0.05)，如图2所示，该结果与基因芯片的结果一致。

2.3活动性肺结核患者抗结核药治疗后miR-20a-5p分子的表达情况 为了明确miR-20a-5p分子在抗结核药物治疗前后的变化情况，选取5位活动性肺结核患者进行动态随访，患者严格遵从医嘱，按时服药，定期检查。我们分别采集5位患者在用药前，抗结核药物治疗3个月、6个月后的外周血再次检测miR-20a-5p的表达。结果显示，在用药前，患者体内miR-20a-5p的表达水平相对较低，随着用药时间的增加，miR-20a-5p的表达水平增加，如图3所示，提示在活动性肺结核患者药物治疗后，结核菌被清除或受抑制，而miR-20a-5p表达反而增加。

2.4体外实验检测在结核菌感染人单核细胞后miR-20a-5p分子的表达 为了在体外再次验证miR-20a-5p的表达情况，随后我们用结核菌强毒株H37Rv、弱毒株H37Ra以及BCG在MOI=10时分别感染分化的人单核细胞，在不同时间点(0～480 min)提取RNA进行检测。结果显示，三种菌株感染人单核细胞后，miR-20a-5p分子的表达均显著下调，以弱菌株下调更为显著，如图4所示。

图2 TaqMan qPCR验证miR-20a-5p在三组人群中的表达情况Fig.2 miR-20a-5p expression was confirmed by TaqMan qPCR among 3 groups

图3 药物治疗前后miR-20a-5p分子的表达情况Fig.3 Expression of miR-20a-5p before and after drug treatment

图4 BCG、H37Ra、H37Rv感染人单核细胞后miR-20a-5p分子的表达情况Fig.4 Expression of miR-20A-5P after BCG,H37Ra and H37Rv infecting human monocytes

3 讨论

现阶段，临床抗结核药物较多，吡嗪酰胺、异烟肼、乙胺丁醇、利福平等，均比较常用，但这些药物使用后不仅容易产生副作用，严重影响其预后的生活质量，而且容易产生耐药性，严重阻碍抗结核的治疗。因此，找出副作用少、疗效佳的抗结核药是治疗结核病的重要方向。研究证实，miRNA可直接或间接实现对靶基因的调控，参与细胞周期变化及其增殖与凋亡过程，在微生物感染过程中与机体免疫应答、炎症反应密切相关[12]。有文献报道，结核患者体内表达各异的miRNA，可视为诊断结核的潜在生物标识[13-15]。

本研究着眼于CD14+单核细胞，将其视为作用靶点，借助miRNA芯片技术，进行相关检验和分析，结果证实，HD 、LTBI、 PTB人群中，miR-20a-5p是表达差异最显著的miRNA，随即采用TaqMan qPCR技术在大样本人群中进行验证，发现miR-20a-5p分子在活动性肺结核患者中表达下调且表达水平显著低于在HD和LTBI人群中的表达水平。当活动性肺结核患者在抗结核药物治疗后，miR-20a-5p的表达水平逐渐上调。体内实验表明，结核菌感染后人体单核细胞内miR-20a-5p表达下调，在抗结核治疗后miR-20a-5p的下调可逆转。体外实验证实用BCG、H37Ra、H37Rv在MOI=10时分别感染分化的人单核细胞，发现三种菌株均明显抑制miR-20a-5p表达，而以弱毒株下调最为显著。由于单核细胞在机体免疫应答及结核菌感染过程中有重要作用，因此肺结核患者单核细胞中miR-20a-5p分子的差异表达，可准确反映感染结核菌后，机体出现的免疫应答反应，所以，可将其视为诊断结核的潜在生物标记，且也有可能被视为肺结核靶向治疗的新靶点。

不过，本实验对患者miR-20a-5p分子的下调机制并未展开研究，因而对结核菌对单核细胞内miR-20a-5p分子表达水平的影响机制尚不明晰。其次细胞凋亡是机体控制结核分枝杆菌感染的主要防御机制之一，结核病患者体内miR-20a-5p分子表达降低是否与细胞凋亡有关以及通过何种机制来促进凋亡都是未知的，需进一步验证miR-20a-5p在肺结核中的诊断价值，这些都是未来的研究方向。