李都，牛长缨，李峰奇，罗晨

斑翅果蝇气味结合蛋白OBP56h与小分子化合物的结合特征

李都1,2，牛长缨1，李峰奇2，罗晨2

（1华中农业大学植物科学技术学院，武汉 430070；2北京市农林科学院植物保护环境保护研究所北方果树病虫害绿色防控北京市重点实验室，北京 100097）

【】克隆斑翅果蝇（）气味结合蛋白56h（odorant binding protein 56h，OBP56h）基因，诱导表达斑翅果蝇OBP56h重组蛋白(DsuzOBP56h)，研究其与小分子化合物的结合特性。【】通过RT-PCR并设计特异性引物克隆斑翅果蝇ORF全长，从NCBI数据库中下载相似度高的昆虫气味结合蛋白序列，进行序列比对和分析。以Ⅰ和Ⅰ为酶切位点，将OBP56h连入pET-30a(+)原核表达载体，将重组质粒转入BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞。扩大培养阳性菌株,并用IPTG诱导表达DsuzOBP56h重组蛋白。收集菌液，通过超声波破碎细胞得到蛋白，利用Ni-NTA柱纯化蛋白，进行Tris-HCl透析，用BCA法测定蛋白浓度。蛋白用50 mmol·L-1Tris-HCl（pH 7.4）稀释至终浓度2 μmol·L-1，配基用色谱级甲醇稀释至终浓度1 mmol·L-1，以4,4′-二苯胺基-1,1′-联萘-5,5′-二磺酸二钾盐（4,4′-dianilino-1,1′-binaphthyl-5,5′-disulfonic acid dipotassium salt，bis-ANS）荧光探针为报告子，利用荧光竞争结合试验检测DsuzOBP56h蛋白与18种候选小分子化合物配基的结合特性。【】克隆获得了斑翅果蝇的ORF全长，共405 bp，N-端含有19个氨基酸组成的信号肽，具有6个保守半胱氨酸位点，符合OBP的典型特征，与其同属的黑腹果蝇OBP56h进化关系最近。成功连入pET-30a(+)表达载体，在1 mmol·L-1IPTG、28℃条件下诱导DsuzOBP56h蛋白表达，并过柱纯化得到目的蛋白。荧光光谱试验显示，荧光探针bis-ANS与DsuzOBP56h的解离常数为0.9568 μmol·L-1，适合作为本试验中竞争性荧光结合试验的报告子；进一步的荧光竞争结合试验表明，在18种候选配基中，苦味……