庄金秋 梅建国 张颖 苗立中 王玉茂

摘  要：H7N9亚型禽流感病毒是我国于2013年3月首次从人群中发现的一种新亚型禽流感病毒。该病毒在家禽中无明显致病性，却能感染人类并引起较高的病死率。因此，H7N9病毒的早期的快速检测对于疫情的控制至关重要。本文对H7N9病毒实验室最新研究进展进行了综述，以期为科研工作者和广大养殖场户更好地研究和防治本病提供参考。

关键词：禽流感病毒;H7N9;检测;研究进展

中图分类号：S858.31     文献标识码：A     文章编号：1673-1085（2019）06-0053-07

禽流感是由禽流感病毒（Avian Influenza Virus，AIV）引起的一种急性呼吸道传染病，具有传染性强、传播速度快、抗原易变异等特点。禽流感病毒是甲型流感病毒的一种，依据流感病毒表面血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）蛋白抗原性不同，理论上HA与NA的不同组合可形成多达144种不同亚型的禽流感病毒。H7N9亚型禽流感病毒是我国于2013年3月首次从人群中发现的一种新亚型禽流感病毒[1]。H7N9病毒最显著的特征之一是在家禽中无明显致病性，却能感染人类并引起较高的病死率。虽然H7N9病毒在禽类身上呈现弱毒性，但携带病毒[2]。因此，H7N9病毒早期的快速检测对于疫情的控制至关重要。本文对H7N9病毒的实验室最新研究进展进行了综述，以期为科研工作者和广大养殖场户更好地研究和防治本病提供参考：

1  病毒分离与鉴定

病毒分离鉴定是禽流感病毒H7N9亚型病原学诊断的“金标准”。采集新鲜标本接种到SPF鸡胚、MDCK或LLC～MKZ细胞中进行培养，根据细胞病变效应（CPE）、血凝和血凝抑制试验（HA&HI）来判定培养液中是否含有流感病毒。杨式芹等[3]（2013）利用SPF鸡胚从H7N9流感病毒患者的咽拭子标本中分离出该病毒。病毒分离鉴定由于培养耗时长，操作繁琐，不利于快速诊断，而且H7N9病毒分离需在经过批准的BSL-3级实验室开展，一般基层实验室不具备这种试验条件，不易实施。

2  血清学方法

2.1  血凝抑制试验（HI）  HI试验是测定禽流感病毒血清抗体最常用的方法。H7N9亚型禽流感病毒血清学检测对于鸡群H7N9亚型禽流感病毒的感染情况和免疫水平的監测具有重要意义。在我国，高致病性禽流感病毒的免疫防控策略是通过灭活疫苗的免疫维持鸡群中高抗体水平，国家规定鸡群个体H7N9亚型禽流感HI抗体效价≥4log2、群体免疫合格个体数量占群体总数的70%（含）以上的标准[4]。HI对检验者专业要求高且工作量大，不利于开展大规模抗体水平监测。

2.2  酶联免疫吸附试验（ELISA）  ELISA方法具有灵敏、快速、高效、简便、高通量等优点，并且待检血清不需要进行前处理，因此更加适合实验室和田间大批样本抗体水平监测，对鸡群及时、精准的免疫提供指导。王洋等[5]（2017）建立了一种基于H7N9流感病毒H7-53TM HA蛋白为抗原的间接ELISA方法，能够检测不同分支疫苗株免疫的H7N9亚型禽流感病毒抗体，检测结果与HI试验结果具有强相关性。范俊青等[6]（2019）用H7N9标准抗原包被ELISA板，将HRP标记的单克隆抗体作为竞争抗体，建立了检测禽流感病毒H7N9亚型抗体的竞争ELISA方法并制成试剂盒。应用该方法对150份血清样品进行检测，结果与HI试验有99.3%的符合率。

2.3  免疫胶体金技术  免疫胶体金技术具有简便快速、特异性高、实用性强等特点，非常适于基层和现场检测使用，为H7N9亚型禽流感病毒的快速检测提供了一个极好的检测方法，也为生物安全工作提供了极大便利。Chan等[7]（2013）利用7种不同试剂厂家的免疫胶体金试剂与两种分子生物学检测试剂对H7N9流感病毒安徽株和浙江株进行检测，发现免疫胶体金技术与分子生物学检测技术灵敏度相似。Jin等[8]（2014）通过对35例H7N9流感病毒感染患者的140份咽拭子、唾液和粪便标本进行检测，分析发现新型的胶体金快速免疫层析技术比RT-PCR具有高特异性。郑腾等[9]（2017）以荧光纳米颗粒为标记物，采用免疫层析法制备H7N9荧光纳米颗粒试纸条。应用该荧光试纸条与国家标准禽流感RT-PCR方法同时对200份样品进行检测，符合率达到93.5%。

3  分子生物学方法

3.1  RT-PCR  RT-PCR具有特异、敏感、快速等优点，现已广泛应用于H7N9亚型禽流感病毒核酸检测。莫秋华等[10]（2013）针对H7N9亚型禽流感病毒的HA和NA基因设计特异性引物，建立一步法四重RT-PCR方法，对30份核酸样品经盲法试验评价与实时荧光定量RT-PCR检测结果符合率为100%。王云鹤等[11]（2015）也根据H7N9亚型禽流感病毒HA和NA核苷酸序列，设计并合成2对引物，建立了快速检测H7N9亚型禽流感病毒的一步法RT-PCR方法，可以从阳性棉拭子浸出液中扩增出目的基因片段。蒋文明等[12]（2015）也针对H7N9亚型禽流感病毒的HA基因和NA基因保守序列，在建立H7亚型和N9亚型单项RT-PCR的基础上，建立了同时检测H7亚型和N9亚型的双重RT-PCR。利用该方法对30份临床样品进行H7N9病毒检测，与病毒分离的符合率为100%。刘根梅等[13]（2018）根椐H7亚型禽流感病毒的HA基因、N9亚型禽流感病毒的NA基因和所有亚型禽流感病毒M基因的保守序列，分别设计了3对特异性引物，建立了检测H7N9亚型禽流感病毒的三重RT-PCR方法。该方法为快速鉴别和监测H7N9亚型禽流感病毒提供了技术手段，特别是对于尚不具备荧光定量RT-PCR检测条件的实验室，该方法是一种鉴别H7N9病毒的重要检测方法。

3.2  荧光定量RT-PCR  实时荧光定量RT-PCR比常规RT-PCR具有更高的敏感性和特异性，而且可以对样品进行定量分析，已大规模应用于禽流感监测网络实验室。Zhu等[14]（2013）针对1例安徽株和2例上海株H7N9亚型禽流感病毒的HA、NA基因序列设计特异性引物和探针，建立了SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法，其最低检测限为10拷贝。Wong等[15]（2013）设计的一步法实时荧光定量RT-PCR对H7N9亚型禽流感病毒检测，整个检测过程只需要3h，检出限达到0.04 TCID50。罗思思等[16]（2013）、罗宝正等[17]（2014）、周其伟等[18]（2015）先后根据H7N9亚型禽流感病毒HA和NA的基因序列，设计两套特异性的引物和探针，建立了基于TaqMan探针的荧光定量RT-PCR。其方法不但能够将流感病毒H7亚型与其他亚型区分开，而且可将新型N9亚型流感病毒与原有的N9亚型区分开。叶惠仪等[19]（2015）建立的荧光定量RT-PCR方法检测H7N9亚型禽流感抗原，H7体系可以检测到10-10抗原稀释度，N9体系能检测到10-9抗原稀释度，且对H9亚型禽流感抗原、H5亚型禽流感抗原及新城疫抗原无交叉反应。王国政[20]（2014）根据H7N9亚型禽流感保守区M基因、H7基因、N9基因、W及内参RP基因分别设计高度特异性的引物与TaqMan探针，建立了四重荧光定量RT-PCR方法，采用一步法可同时检测上述各基因。张杰等[21]（2018）根据禽流感病毒H7N9亚型HA保守基因、HA裂解位点和NA基因为检测靶标，设计特异性引物和MGB-TaqMan探针，建立了三重荧光定量RT-PCR方法，能够同时检测禽流感病毒H7N9经典毒株和新型变异毒株。由于荧光定量RT-PCR需要特殊的仪器扩增仪，无法满足基层和现场检测的需求。

3.3  PCR-ELISA  PCR-ELISA通过普通PCR扩增，以ELISA作为最终结果判定手段。章倩云等[22]（2016）针对禽流感病毒M基因、H7基因、N9基因3个基因片段的保守序列，设计特异性引物，通过生物素与地高辛的特异性标记，建立了PCR-ELISA联合检测禽流感病毒的方法。其敏感度比普通PCR提高了100倍。相比于实时荧光定量PCR，此方法不需要昂贵的仪器，操作也更加简单，更易于普及使用，为禽流感病毒的流行病学调查和早期诊断提供了新的方法。

3.4  等温核酸扩增技术  近年来新型等温核酸扩增技术极大缩短了核酸扩增检测时间，得到了快速的发展，逆转录-环介导等温扩增技术（RT-LAMP）、依赖核酸序列的等温扩增技术（NASBA）、重组酶聚合酶介导的等温扩增技术（RPA）、解旋酶依赖性等温扩增技术（HDA）等已被成功应用于禽流感病毒的检测。

3.4.1  逆转录-环介导等温扩增技术（RT-LAMP）   RT-LAMP技术具有特异性强、灵敏度高、简便快速、检测结果可视化，无需特殊设备等优点，非常适合基层H7N9亚型禽流感病毒的早期快速检测，在禽流感病原监测上具有较好的应用前景。董志珍等[23]（2013）利用RT-LAMP检测H7N9亚型禽流感病毒安徽株，其灵敏度达到10个拷贝，灵敏度与实时荧光定量RT-PCR一致，但从检测时间上看RT-LAMP完成1次检测可在1.5h内，而实时荧光定量RT-PCR则需要3h。Zhang等[24]（2013）利用RT-LAMP对135份H7N9亚型流感病毒临床样本进行检测，H7亚型基因的检出限度为10拷贝，N9基因检测限度为5拷贝，灵敏度是实时荧光定量RT-PCR的100倍。张锦海等[25]（2015）成功建立了检测H7N9亚型禽流感病毒的HA基因、NA基因的RT-LAMP方法。对142份临床标本进行检测，检测HA基因、NA基因的敏感性分别达到10拷贝/反应、5拷贝/反应。崔淑娟等[26]（2015）针对H7N9亚型禽流感病毒HA基因的7个区域设计5条特异性引物，建立RT-LAMP方法，最低检出限为0.01pg。对69份临床疑似标本利用该RT-LAMP方法和实时荧光定量RT-PCR方法同时进行检测，其检测结果的灵敏度、特异度和总符合率均为100%。

3.4.2  依赖核算序列的扩增技术（NASBA）    NASBA技术具有特异性强、灵敏度高、反应迅速和操作简单等特点，特异性和灵敏性均高于PCR，使用的过程当中不需要PCR仪等特殊的设备，只使用恒温水浴锅就可以完成整个扩增反应过程，更適合基层实验室使用。Collins等[27]（2003）基于M基因和H7亚型禽流感病毒的HA基因已成功开发出可检测禽流感群特异性H7亚型（NASBA-H7）的NASBA/ECL检测试剂盒，比商品化的免疫检测试剂盒敏感性至少高1000倍，比常规PCR方法也敏感许多，与现行病毒培养的检测方法的灵敏度相当，只需6h就可准确无误地检测出病毒。该方法的优点是RNA分子不易对实验仪器和环境造成污染，避免了试验结果的假阳性，缺点是检测成本过高。

3.4.3  重组酶聚合酶介导的等温扩增技术（RPA）  RPA被称为是可以替代PCR的新型核酸检测技术，具有操作简便、反应快速、特异性好、灵敏度高等特点，为H7N9亚型禽流感病毒的现场快速检测提供了新的分子工具。赵康辰等[28]（2016）根据H7N9亚型禽流感病毒HA基因和NA基因的保守区序列，分别设计引物及探针，建立RT-RPA方法。结果显示，H7反应体系和N9反应体系的最低检出限分别为10拷贝/μl和100拷贝/μl，与实时荧光定量RT-PCR一致性较高。王潇等[29]（2018）根据禽流感病毒H7亚型的HA保守序列，并按照RPA引物探针的要求，设计多对引物及探针，建立RT-RPA方法。该方法与实时荧光定量RT-PCR方法相比，灵敏性稍差，但该方法的检测快速，仅需要20min。

3.4.4  解旋酶依赖性等温扩增技术（HDA）  HDA技术是模拟体内DNA复制机制的体外等温扩增技术，原理简单、操作方便、适用范围广，特别适合诊断产品开发，在H7N9亚型禽流感病毒现场快速检测方面也具有很大的应用空间。方斌等[30]（2018）根据H7N9亚型禽流感病毒HA基因作为靶标区域设计引物，采用FITC和Biotin标记上下游引物，通过RT-HDA技术扩增病毒RNA，辅以胶体金免疫层析试纸检测核酸扩增产物，建立了检测H7N9亚型禽流感病毒的等温扩增方法。该方法病毒最低检测限20个拷贝数/μl，具有较好的灵敏度、特异性和重复性，无需大型PCR仪设备和凝胶电泳检测，便于现场和基层简单快速检测H7N9亚型禽流感病毒。

3.5  测序技术

3.5.1  高通量测序技术（HTS）  HTS技术又名下一代测序，该方法不需要进行PCR扩增，具有准确性高、周期短、可同时对多个样本进行检测且成本相对较低等优点，使大规模H7N9流感病毒基因组检测变为现实。赵康辰等[31]（2013）、裴广倩等[32]（2014）先后以U12引物反转录cDNA，通用流感病毒全基因扩增引物混合物生成双链cDNA制备高通量测序模板对H7N9流感病毒样本进行检测。结果显示不同CT值的样本用高通道测序都能检测到流感病毒，从模板制备、文库构建到序列及数据分析等在2d内可完成。王楷宬等[33]（2016）研究显示在一次测序中完成了H7N9禽流感病毒全部8个基因的序列，能够满足对H7N9亚型流感监测、全基因分析和溯源研究的要求。

3.5.2  焦磷酸测序技术（Pyrosequencing）  焦磷酸测序技术是一种新型的酶联级联测序技术。以H7N9流感病毒NA焦磷酸测序检测方法，可用于H7N9禽流感病毒的检测和鉴定。赵永刚等[34]（2014）建立H7N9流感病毒NA基因分子标签的焦磷酸测序检测方法，对3株H7N9流感病毒分离株的检测，结果表明3株H7N9流感病毒的NA基因均存在15个核苷酸缺失的分子标签。

3.6  芯片技术

3.6.1  基因芯片（Gene Chip）  又称DNA芯片、生物芯片。王秀荣等[35]（2005）依据M蛋白进行基因型鉴定和HA基因亚型鉴定，用Cy5荧光标记在基因芯片平台上构建检测H7亚型禽流感病毒的实验技术模型，检测H7亚型的cDNA，杂交达到预期结果。韩雪清等[36]（2008）根据H7亚型的基因序列，设计特异性引物和探针，制备了H7亚型禽流感病毒鉴定基因芯片，利用收集自49个地区的2653分标本进行评价，显示该病毒基因芯片具有良好的特异性和敏感性。王慧煜等[37]（2009）对29份H7亚型阳性标本进行正向杂交基因芯片检测，结果与病毒分离的结果符合率达100%。基因芯片技术具有特异性好、检测时间短等优点，但因其存在检测成本高、硬件要求高，一般的实验室无法开展等缺点，在禽流感病毒检测中的应用还远低于其他检测方法。

3.6.2  液相芯片（MASA）  液相芯片，也称为悬浮阵列、流式荧光技术。该技术具有高通量、敏感性高、速度快的特点，已经在基因分型、组织分型、感染性疾病的检测等方面得到了广泛应用。张晓娜等[38]（2013）针对H7亚型禽流感保守基因，设计特异性引物和探针，将多重不对称RT-PCR扩增产物与偶联荧光微球的探针进行杂交，建立多重液相芯片检测方法，对50份已知病毒的样品进行液相芯片方法和禽流感检测试剂盒双盲试验，两者符合率为100%。袁靜等[39]（2015）建立了一种同时对H5N1和H7N9亚型流感病毒进行快速检测的液相芯片新方法，可以对含有5个拷贝的样本进行有效的基因分型，同时检测速度快，从样本RNA的提取到最后结果的判断可在8h内完成。

3.7  高分辨率熔解曲线（HRM）  HRM高分辨率熔解曲线是一种基于单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线的基因分析新技术。该技术具有灵敏度高、特异性好、成本低廉、高通量检测、闭管操作等优点，已广泛应用于突变扫描、单核苷酸多态性分析、甲基化研究、基因分型、序列匹配等方面。刘志成等[40]（2016）针对H7N9亚型禽流感病毒HA和NA基因的保守区域，分别设计2对特异性引物，建立了基于HRM分析H7N9亚型禽流感病毒的检测方法。临床样本检测与某商品化H7N9亚型禽流感病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒符合率为100%。表明该方法可用于H7N9亚型禽流感病毒的临床筛查和监测。

4  结语

综上所述，由于我国严格的生物安全管理规定，高致病性的流感病毒和禽流感病毒分离等操作被严格限定在生物安全三级实验室进行[41]。因此，一般基层常规实验室对疑似标本的病原学鉴定只能进行分子生物学检测。分子生物学技术具有敏感性高、特异性强、简便、快速等优点，为H7N9亚型禽流感病毒提供了快速准确的检测，为疫情的有效防控提供了准确的流行病学信息，避免了疫情的大规模蔓延[42]。但分子生物学技术也各有优缺点和实用性。相信随着现代分子生物学、微生物学及免疫学等学科的发展，以及同其它学科间的相互渗透，H7N9亚型禽流感病毒的传统检测技术将与现代分子生物学技术有机结合，取长补短，推进禽流感病毒分子生物学检测技术进入新的发展阶段。

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Abstract：The H7N9 subtype avian influenza virus is a new subtype of avian influenza virus that was first discovered in China from people in March 2013.The virus has no obvious pathogenicity in poultry， but it can infect humans and cause a high mortality rate.Therefore， the early rapid detection of the H7N9 virus is critical for the control of the epidemic.This paper reviews the latest research progress of H7N9 virus laboratory， in order to provide reference for researchers and farmers to better study and prevent this disease.

Key Words：Avian Influenza Virus;H7N9;Detection;Research progress□