扈琴吉 杨宏禹 路晓 于可响 孙晓军

摘  要：基于A型和C型鸭甲肝病毒（Duck hepatitis A virus，DHAV）3D基因的6个保守区域设计了4条引物，利用Bst DNA聚合酶在60℃恒温保持45min即可完成反转录和扩增反应，由此建立了鸭甲肝病毒的一步反转录环介导等温扩增（RT-LAMP）方法。该方法具有良好的特异性，除DHAV外，对其他4种常见鸭病的检测结果均为阴性。该方法对DHAV-A和DHAV-C病毒RNA的最低检出量均为0.1pg，是常规RT-PCR方法的10倍。临床应用结果表明，该方法与病毒分离鉴定方法的符合率为92.5%，而且对仪器要求低，适于基层实验室和现场检测。

关键词：鸭甲肝病毒;3D基因;一步反转录环介导等温扩增;仪器要求低

中图分类号：S858.32     文献标识码：B     文章编号：1673-1085（2019）06-0038-05

鸭甲肝病毒（Duck hepatitis A virus，DHAV）引起的鸭病毒性肝炎是困扰我国养鸭业发展的主要疾病之一。该病毒主要感染3周龄内的雏鸭，感染率高、发病快、死亡率高，若不及时治疗，死亡率可达50%以上。该病波及面广、发病率高、危害严重，每年都会给我国的养鸭业造成严重的经济损失。鸭甲肝病毒分为A、B、C三个基因型，它们之间无抗原交叉性，目前在我国流行的主要是A型和C型[1-3]。

环介导等温扩增（LAMP）技术是一种新的体外扩增特异性基因的分子生物学方法[4]。该方法只需要简单的水浴锅，在30～90min内即可扩增大量的目的基因，而且可以不需要核酸电泳的方法来判断结果，仅通过在紫外线下肉眼观察就能判断结果，具有特异性强、灵敏度高、检测快速、仪器要求低、成本低廉等优点，非常适合在基层实验室，甚至现场进行快速诊断[5-6]。本研究正是根据LAMP技术的原理，建立了快速检测鸭甲肝病毒的一步反转录环介导等温扩增（RT-LAMP）方法，并进行了初步的临床应用。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  毒株  A型鸭甲肝病毒（DHAV-A）、C型鸭甲肝病毒（DHAV-C）、新型鸭呼肠孤病毒（NDRV）、新型鸭细小病毒（NDPV）、鸭瘟病毒（DPV）和鸭坦布苏病毒（DTMUV）均由山东省农业科学院家禽研究所分离、保存。

1.1.2  试剂与材料  病毒核酸提取试剂盒购自AXYGEN公司;RNA酶抑制剂、反转录酶购自TaKaRa公司; One Step RT-PCR Kit购自南京诺唯赞生物技术有限公司;Bst DNA聚合酶（大片段）购自NEB公司;甜菜碱（betaine）购自Sigma公司;SYBR Green I购自Invitrogen公司。其他试剂均为国产或进口分析纯。

SPF鸭胚由山东昊泰实验动物公司提供。

1.2  方法

1.2.1  病毒增殖与纯化  将A型鸭甲肝病毒和C型鸭甲肝病毒分别做1000倍稀释，经尿囊腔接种11日龄SPF鸭胚，0.1ml/枚，各5枚，弃掉24h内死亡的鸭胚，收集24～120h死亡鸭胚的尿囊液，经蔗糖密度梯度离心进行浓缩纯化，用于病毒DNA提取。

1.2.2  引物设计与合成  参考GenBank已发表的DHAV-A和DHAV-C的3D基因保守区域，利用Primer5.0软件，设计针对6个区域的4条LAMP引物，包括2条外引物（DHV-F3和DHV-B3）、2条内引物（DHV-FIP和DHV-BIP），引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。引物序列见表1。

1.2.3  反应条件优化  参考已报道的RT-LAMP实验条件[7-8]，首先通过调整甜菜碱（Betaine）浓度、MgSO4浓度、扩增温度和扩增时间对反应体系和条件进行优化，具体梯度如下：Betaine終浓度分别为0.2、0.4、0.8、1.6mol/L;MgSO4终浓度分别为1、3、5、7mmol/L;反应温度分别为58、60、62、64、66℃;反应时间分别为30、45、60min。在确立初步反应体系和条件的基础上，对引物浓度进行进一步优化，内外引物浓度比例分别按6倍、8倍、10倍的组合进行，具体组合见表2。反应结束后，在PCR管中加入1μl 10倍稀释的SYBR GreenⅠ，混匀后在紫外线下观察，若有黄绿色荧光，可判断为阳性。

1.2.4  特异性试验  分别提取A型鸭甲肝病毒、C型鸭甲肝病毒、新型鸭呼肠孤病毒、新型鸭细小病毒、鸭瘟病毒和鸭坦布苏病毒的RNA，利用上述优化的方法进行RT-LAMP检测，反应结束后，在PCR管中加入1μl 10倍稀释的SYBR GreenⅠ，混匀后在紫外线下观察，若有黄绿色荧光，可判断为阳性。

1.2.5  敏感性试验  分别提取A型和C型鸭甲肝病毒的RNA，利用分光光度计测定RNA的含量，并将这些RNA稀释至20、2、0.2、0.02、0.002、0.0002pg/μl等六个浓度（即RT-LAMP检测体系中RNA含量分别为100、10、1、0.1、0.01、0.001pg），然后进行RT-LAMP反应。反应结束后，在PCR管中加入1μl 10倍稀释的SYBR GreenⅠ，混匀后在紫外线下观察，若有黄绿色荧光，可判断为阳性。同时以上述不同含量的RNA为模板，以DHV-F3/DHV-B3为引物进行一步法RT-PCR反应，反应体系（25μl）如下：2×One Step mix 12.5μl，引物DHV-F3（10μmol/L）0.5μl，引物DHV-B3（10μmol/L）0.5μl，RNA模板5μl，无RNA酶水6.5μl。反应程序为：50℃ 30min;94℃ 3min;94℃ 15s，60℃ 15s，72℃ 30s，30个循环;72℃ 5min。扩增结束后电泳观察，出现大小为353bp的单一条带判为阳性。并将这两种方法的敏感性进行比较。

1.2.6  临床应用  从不同鸭场收集疑似病料40份，利用本研究建立的RT-LAMP方法进行检测，同时将样品处理后经尿囊腔接种11日龄SPF鸭胚进行分离，盲传3代后，利用阳性血清通过中和试验对分离物进行鉴定，并比较两种方法的符合性。

2  结果

2.1  RT-LAMP反应体系与条件优化  优化后的反应体系（25μl）为：10×Bst buffer 2.5μl、dNTP（10mmol/L）1.5μl、MgCl2（25mmol/L）3μl、betaine（5mol/L）2μl、外引物DHV-F3、DHV-B3（10μmol/L）各0.5μl、内引物DHV-FIP、DHV-BIP（40μmol/L）各1μl、RNA酶抑制剂（40U/μl） 1μl、反转录酶AMV（5U/μl）1μl、Bst DNA聚合酶（8U/μl）1μl、RNA模板5μl、无RNA酶水5μl。

优化后反应条件为：60℃ 45min，85℃ 2min。

2.2  特异性试验  利用优化的RT-LAMP方法对A型和C型鸭甲肝病毒以及其他常见的鸭病病原进行检测，结果显示，仅A型和C型鸭甲肝病毒检测结果为阳性（图1）。

2.3  敏感性试验  提取A型和C型鸭甲肝病毒的RNA，利用分光光度计测定RNA的含量分别为403ng/μl和286ng/μl，将RNA稀释成6个不同的浓度，分别利用RT-LAMP方法和常规RT-PCR方法进行检测。结果显示，RT-LAMP方法对A型和C型鸭甲肝病毒RNA的最低检出量均为0.1pg，其敏感度是常规RT-PCR方法的10倍（图2）。

2.4  临床应用  利用RT-LAMP方法从40份临床样品中检出阳性样品22份，阳性检出率为55.0%，而病毒分离鉴定检出阳性样品19份，阳性检出率为47.5%，两种方法的符合率为92.5%（表3）。

3  讨论

鸭甲肝病毒的实验室诊断可以采取传统的血清中和试验，但该方法存在耗时长、不易标准化等缺点。也可以采取快速灵敏的分子生物学检测技术，如RT-PCR、荧光RT-PCR等方法，但这些方法需要PCR仪、电泳系统、凝胶成像系统等较为复杂的仪器设备，不适合在广大基层实验室推广应用。本研究建立的鸭甲肝病毒一步RT-LAMP方法具有快速、准确、灵敏等优点，特别是对仪器设备要求低，基因扩增和结果判断只需要1台水浴锅、1台紫外分析仪，因此非常适合在基层实验室，甚至现场进行快速诊断。该方法耗时短，从收到病料到获得结果只需2.5h：病料处理1h、核酸提取0.5h、核酸扩增0.9h、染色观察0.1h。而常规RT-PCR检测大约需要4.3h：病料处理1h、核酸提取0.5h、反转录0.8h、核酸扩增1.5h、电泳0.5h;荧光RT-PCR检测大约需要3.5h：病料处理1h、核酸提取0.5h、核酸扩增2h。该方法对鸭甲肝病毒RNA的最低检出量为0.1pg，其敏感度是利用相同的外引物建立的常规RT-PCR方法的10倍。这与Chen等[9]利用RT-LAMP方法檢测猪瘟病毒以及吴彤等[10]利用LAMP方法检测鸭疫里默氏杆菌的研究结果一致。LAMP检测方法的灵敏度与反应体系和条件有较大的关系 [11-12]，因此我们对本方法的反应体系与条件进行了优化。在优化过程中，我们发现，Mg2+浓度、Betaine浓度、内外引物的浓度与比例以及反应温度对扩增效率影响较大。当Mg2+终浓度为1mmol/L或7mmol/L时对扩增效率有较明显的抑制作用。Betaine最佳终浓度为0.4mol/L。通常LAMP的反应温度在60～65℃之间[8]，本研究中当反应温度为64℃和66℃时，产物荧光亮度相对较淡，而反应温度在58℃、60℃和62℃时荧光亮度差别不大。反应时间分别设为45min和60min时，荧光亮度差别不大，而30min时荧光亮度明显减弱。通过对不同引物浓度组合进行比较，确定了外引物的最佳终浓度为0.2μmol/L，内引物的最佳终浓度为1.6μmol/L。

LAMP检测技术的一个最大的缺点是容易出现假阳性，这主要是由于空气中存在阳性核酸气溶胶污染造成的，可以通过两种途径来解决这个问题：一是将反应液配制区、扩增区和结果观察区严格隔离开;二是每次检测设置空白对照[13]。

参考文献：

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[12]  张跃伟，李旭妮，郭盼盼，等.荧光显色在环介导等温扩增（LAMP）检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的应用[J].农业生物技术学报，2010，18（3）：508-513.

[13]  于可响，马秀丽，韩宏宇，等.新型鸭呼腸孤病毒RT-LAMP检测方法的建立[J].生物技术通报，2015，31（8）：71-75.

Abstract：An one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification （RT-LAMP） assay for detecting duck hepatitis A virus （DHAV） was established with four primers based on six conserved positions of the 3D gene. The process of assay was completed by using Bst DNA within 45 min at 60℃. The detect limit of the RT-LAMP assay was 0.1 pg of viral RNA， which was 10 times higher than RT-PCR， and no amplification was found with the samples of 4 other common duck diseases. The clinical application results showed the coincidence rate between the assay and the virus isolation and identification is 92.5%. The assay was a potential useful technique for DHAV detection in field condition.

Key Words：Duck hepatitis A virus; 3D gene; One-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification; Low requirement for instrument