王晓飞 沈运旺 朱珏 张博

摘 要 慢性无机砷暴露可引发多种疾病和损害， 但其所涉及的生物学过程尚未完全阐明。全球约有超过2亿人面临饮用水砷污染的威胁。本研究以自由饮水的方式对健康大鼠进行无机砷的长期暴露， 并对大鼠尿液的代谢组变化进行系统分析。结果表明， 长期砷暴露大鼠的尿液代谢组与对照组具有显著区别， 且高剂量砷暴露对大鼠尿液代谢组产生的影响更显著。本研究共鉴定出36种差异代谢物， 其中14种与氨基酸代谢相关的代谢物发生了显著变化， 涉及到色氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、赖氨酸降解、β-丙氨酸代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢; 11种与脂类代谢相关的代谢物， 涉及到的代谢通路有鞘脂代谢、脂肪酸代谢; 同时发现蛋白质的表达与翻译后修饰也受到干扰。这些生物学过程的改变均可作为砷毒性机理的关键分子事件。

关键词 砷暴露; 代谢组学; 尿液; 长期暴露; 液相色谱-质谱

1 引 言

砷广泛存在于环境中， 无机砷具有极大毒性， 已被国际癌症研究机构（IARC）列为I类致癌物。饮用水砷污染是人类暴露于砷的主要途径[1，2]， 在全球范围内有超过2亿人的饮用水中含有较高浓度的砷。高砷地区的流行病学调查表明， 慢性无机砷暴露与多种疾病风险的增高具有相关性[3～5]， 近期的研究发现， 即使普通环境剂量的饮水砷暴露也存在一定的健康风险[6，7]。近年来快速展的组学技术已被应用于砷毒性的研究中， 基于动物模型的蛋白质组学研究发现， 砷暴露能够损害心血管系统的发育和正常功能[8]。在低剂量砷暴露人群的尿液代谢组学研究中， 发现五价无机砷暴露量的升高与男性不育呈现相关性， 并且砷可能引发氧化应激增强和扰乱性激素代谢过程[7]。

代谢组学技术是系统生物学的重要组成部分， 基于现代色谱-质谱联用平台对代谢物进行研究， 通过分析生物体中代谢物的变化， 揭示生命活动规律[9，10]。代谢组学技术应用于污染物毒性研究， 可以直接观察到与污染物相关的代谢物变化， 进而在小分子层面揭示污染物的毒性机理[11～13]。代谢组学技术在毒性机理研究中仍存在许多挑战， 如代谢组学技术研究方法的多样性[14]、追踪代谢物变化所影响的特定代谢途径和毒性效应仍具有挑战性[15，16]、代谢物浓度的巨大差异带来的检测困难， 以及由于鉴定能力和数据库不完善带来的大量代谢物质谱信息数据浪费[17]。

代谢物是连接环境风险因素与生物体健康的桥梁。如血液和尿液中的代谢物变化可以反映个体在分子层面对环境胁迫的响应， 高通量代谢组学能够筛选代谢物的变化[6，7，18，19]，  进而全面了解环境胁迫对生物体代谢通路的影响。该策略已应用于小鼠、蛤和跳蚤的砷暴露代谢干扰效应研究[20～23]。 在现有的砷毒性研究中， 多采用急性和高剂量的砷暴露模式， 尚不能真实反映出人饮水型长期砷暴露的实际情况。本研究对大鼠进行长期的无机砷饮水暴露， 覆盖了大鼠幼年至成年期， 分析了尿液代谢组， 基于代谢组学的高分析通量和差异代谢物的筛选功能， 将砷暴露与尿液代谢物的相应变化关联， 结合相关代谢通路分析探究了长期无机砷暴露的毒性机理， 以期对长期砷暴露的健康风险评估提供参考。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

ACQUITY超高效液相色谱仪（美国Waters公司）-Q Exactive质谱仪（美国Thermo公司）联用代谢组学检测平台。 甲醇（色谱纯， 德国Merck公司）; 甲酸（质谱纯， 百灵威J&K公司）; NaAsO2（纯度>98.5%， 比利时Acros公司）; 去离子水由Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司）制备。

2.2 实验方法

2.2.1 动物实验分组与染毒方法 SD（Sprague-Dawley）雄性大鼠（4周龄， 体重80 g）购自上海SLAC动物实验中心。大鼠饲养于温度为（26 ± 2）℃、相对湿度为50%±5%、12/12 h昼夜循环的动物房内， 所有大鼠自由摄取食物和饮用水。经过一周的适应性饲养和检疫后， 大鼠随机分成3组， 每组10只。暴露组大鼠分别饮用浓度为1.0和25.0 mg/L的NaAsO2溶液， 对照组大鼠饮用去离子水。

經过150天暴露后， 利用代谢笼收集大鼠尿液， 在4℃以12000 g离心10 min， 于80℃储存， 待分析。

2.2.2 尿液检测 （1）样品制备 从80℃取出尿液， 依次在20℃和4℃下逐步解冻。每种样品中取出500 μL尿液， 加入等体积的去离子水， 在4℃以12000 g离心10 min， 取上清液， 待测。同时， 从每种样品中取出20 μL混匀， 作为质量控制（QC）样品。（2）液相色谱分离条件 利用UPLC/Q Exactive-MS联用平台采集尿液代谢指纹图谱， 使用Waters公司的ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（100 mm × 2.1 mm × 1.8 μm）; 流动相A为含有0.1%甲酸的水溶液， 流动相B为含有0.1%甲酸的甲醇溶液， 梯度洗脱条件：初始流动相为0.1% B， 维持1 min， 4 min时升至6.0% B， 15 min时升至50% B， 21 min时升至99.9% B并维持2.5 min， 随后快速恢复初始0.1% B， 并保持1.5 min; 进样体积为10 μL; 流速为400 μL/min; 柱温为40℃。（3）质谱条件 采用电喷雾离子源（ESI）， 同时在正、负离子模式下采集数据， Full MS分辨率为17500， 扫描范围为m/z 100～1000。载气为氮气， 正、负模式下喷针电压均为3500 V， 离子传输毛细管温度为320℃; 鞘气和辅助气流量分别为50和12.5 L/min。随机进样， 每种样品检测2次， 以消除人为或仪器造成的系统误差， QC样品每隔10种样品检测1次。Full MS/dd-MS2模式用于获得标志物的二级质谱结构信息， NCE设置为30%。

2.2.3 尿液代谢组检测数据分析 将UPLC/Q Exactive-MS联用平台采集到的代谢物指纹图谱数据导入Compound Discoverer 2.1软件进行峰对齐、代谢物离子信息提取与鉴定， 得到包含代谢物分子量、分子式、离子峰面积的信息表。数据进行归一化后导入SIMCA-P（Version 14.1 MKS Umetrics）， 首先进行主成分分析（PCA）， 基于QC样品聚合情况考察仪器方法的稳定性， 随后进行正交-偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）， 并通过SPSS（Version 24， IBM）和MetaboAnalyst 4.0（https：//www.metaboanalyst.ca/）进行统计学分析。差异代谢物的筛选标准为：VIP值（Variable Importance in the Projection）≥1.5， 两组间变化倍数≥2（暴露组vs对照组）， p<0.05（暴露组vs对照组）。将满足上述条件的代谢物导入HMDB（http：//www.hmdb.ca/）进行检索， 排除非内源性物质和非大鼠物种来源物质， 并对其生物学意义进行分析。

3 结果与讨论

3.1 砷暴露剂量的选择

全球天然水体中砷浓度范围为0.0005～5.0 mg/L， 如印度西孟加拉邦地区的地下饮用水中砷浓度达到了3.7 mg/L[24，25]。饮用水中砷的主要存在状态有As和As [26]， 且As的毒性远大于As[27]， 为了更真实地反映饮水砷暴露的健康影响， 选择NaAsO2溶液作为砷暴露源。在本研究中选用25.0 mg/L NaAsO2作为最高暴露剂量， 相当于14.4 mg/L的砷暴露量， 依据动物与人类间剂量转换算法[28]， 这相当于人类暴露于2.3 mg/L的砷; 为了反映人类常规饮水砷暴露状态， 选用1.0 mg/L NaAsO2作为低暴露剂量组。同样， 25.0 mg/L NaAsO2暴露量（相当于4.0 mg/kg bw）约为大鼠口服半致死量（41.0 mg/kg bw）的1/10[29]。因此， 本研究中使用的暴露剂量涵盖了环境砷暴露最高水平、常规饮水砷暴露水平和大鼠NaAsO2的半致死量， 与环境相关并具有毒理学意义。

3.2 代谢组学分析

在正、负离子2种扫描模式下同时对样品中的代谢物进行检测， 尽可能获得所有代谢物的信息。图1为大鼠尿液代谢组轮廓的代表性指纹图谱， 可以看出谱图中含有丰富的代谢物信息。

在代谢组学分析过程中， 通常伴随着显著的质谱信号漂移， 为了消除这种变化， 常添加一种或多种内标校正信号[30]， 或采用QC样品评估信号漂移状态并进行信号校正[31，32]。本研究采用statTarget工具对所有数据进行校正（QC-RFSC）[32]。QC样品（n=9）检测均匀覆盖全部样品分析序列， 通过对所有QC样品数据中代谢物离子的保留时间和信号强度进行分析， 可以检验方法的可靠性及LC-MS平台的稳定性。采用PCA方法对所有样品数据进行模式识别， 结果如图2所示， QC样品聚合良好， 表明本研究中代谢组学分析方法稳定可靠， 数据质量满足进一步多变量组学分析的要求。

在代谢组学数据分析中， 正交-偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）作为偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA）的改进方法， 常被用于区分两组或多组数据， 与PLS-DA相比， OPLS-DA模型的假阳性率更低， 结果更准确[33]。分别对暴露组与对照组进行OPLS-DA分析和置换检验。如图3所示， OPLS-DA分析表明， 2种剂量组与对照组均能够实现良好的聚类区分， 模型经过验证可靠， 表明长期饮水砷暴露对大鼠的尿液代谢组产生了显著影响。

将提取的代谢物离子信息表导入MetaboAnalyst 4.0进行统计学分析， 对暴露组和对照组中代谢物离子强度变化倍数（FC）及t检验的p值进行比较（图4）， 结果表明， 暴露组与对照组的大鼠尿液中存在大量的差异代谢物（图4中红色圆点， FC>2且p<0.05）， 且高剂量比低剂量暴露组中存在更多的差异性代谢物离子。依据变量在OPLS-DA区分投影中的重要性（VIP）、两组间变化倍数及差异显著性， 最终筛选出36种差异代谢物（表1， 低剂量组14种， 高剂量组32种， 2种剂量组中同时鉴定到10种）。差异代谢物在暴露组与对照组尿液中的变化热图（图6）显示， 13种差异代谢物在砷暴露组大鼠尿液中的含量显著上调， 23种代谢物含量显著下调。将差异代谢物导入MetaboAnalyst 4.0， 经Pathway Analysis和Statistical Analysis分析， 表明差异代谢物涉及氨基酸代谢、谷胱甘肽代谢、嘌呤代谢、鞘脂代谢和氨酰基-tRNA生物合成等通路（图5）。

3.3 基于代谢組学分析的砷暴露毒性效应

3.3.1  长期砷暴露引起生物体整体代谢异常 砷暴露会扰乱机体内氧化/抗氧化平衡， 造成机体氧

化损伤[34，35]， 影响细胞生长[36]、DNA修复[37]和表达调节[38～41]。流行病学研究表明， 砷暴露是糖尿病[42～44]和心血管疾病[45～47]等代谢类疾病的危险因素。尿液中包含了大量代谢物信息， 尿液代谢组学研究已被广泛应用于污染物毒理研究中[18，48，49]， 对大鼠尿液进行代谢组分析， 能够准确地反映出生物体整体代谢轮廓的变化。本研究发现， 经过长期的砷暴露， 大鼠尿液中有14种与氨基酸代谢相关的代谢物发生了显著变化（4种含量上升、10种含量下降）， 在25.0 mg/L暴露组鉴定出12种， 1.0 mg/L暴露组鉴定出8种， 涉及到的氨基酸通路有色氨酸代谢（Tryptophan metabolism）、精氨酸和脯氨酸代谢（Arginine and proline metabolism）、赖氨酸降解（Lysine degradation）、β-丙氨酸代谢（β-Alanine metabolism）、半胱氨酸和蛋氨酸代谢（Cysteine and methionine metabolism）、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢（Glycine， serine and threonine metabolism）（图5）; 同时， 也鉴定出11种与脂类代谢相关的代谢物（6种含量上升、5种含量下降）， 其中在25.0 mg/L暴露组鉴定出10种， 1.0 mg/L暴露组鉴定出2种， 涉及到的代谢通路有鞘脂代谢（Sphingolipid metabolism）、脂肪酸代谢。慢性砷暴露已被证明与糖尿病和心血管疾病密切相关， 这些疾病的典型特征是生物体内糖类、脂类和氨基酸的代谢紊乱[50，51]。以上结果表明， 长期砷暴露能够引起生物体整体代谢异常， 并且高剂量（25.0 mg/L）暴露比低剂量（1.0 mg/L）暴露产生的代谢影响更显著。

3.3.2 长期砷暴露扰乱氧化/抗氧化平衡， 引起核苷酸代谢紊乱 砷暴露能够引起生物体产生多种损伤， 其毒性机理在分子层面还未完全明确， 氧化/抗氧化失衡导致的氧化应激是被广泛接受和深入研究的方向之一[52]; 长期砷暴露引起的氧化/抗氧化失衡是众多砷毒害的诱因， 进而造成致癌、遗传毒性、生殖毒性、皮肤损伤、代謝系统和神经系统病变等[34]。在砷暴露大鼠尿液中鉴定出涉及谷胱甘肽代谢通路的代谢物有精胺（Spermine）、亚精胺（Spermidine）和焦谷氨酸（Pyroglutamic acid）， 且含量均下降。这表明砷暴露可能破坏了大鼠体内的谷胱甘肽代谢循环（机体内维持氧化/抗氧化平衡的重要生物学过程）[53，54]， 进而对大鼠机体产生氧化损伤。另外， 暴露组中5种与核苷酸代谢相关的代谢物产生了显著变化（2种含量上升， 3种含量下降）， 其中， 次黄嘌呤（Hypoxanthine， 下降）和黄嘌呤（Xanthine， 上升）是尿酸（Uric acid， 上升）合成的前体， 尿酸是嘌呤氧化的最终产物， 这表明长期砷暴露可能通过扰乱机体内氧化/抗氧化平衡， 干扰核苷酸代谢， 并影响机体内正常的生物学过程。

3.3.3 长期砷暴露干扰蛋白质表达与翻译后修饰 氨基酸的tRNA转运及蛋白质翻译后修饰对于蛋白质的合成和功能化具有重要意义。与对照组相比， 砷暴露组中蛋氨酸（Methionine）和N-乙酰基-赖氨酸（N6-acetyllysine）的含量分别显著上升和下降。蛋氨酸与氨酰-tRNA的生物合成过程相关， N-乙酰基-赖氨酸是一种乙酰化氨基酸， 赖氨酸乙酰化是一种重要的蛋白质翻译后修饰， 这说明长期砷暴露扰乱了大鼠体内蛋白质的表达和翻译后修饰过程。

4 结 论

利用代谢组学技术对不同剂量长期饮水砷暴露大鼠尿液的代谢组进行了对比分析， 发现长期砷暴露对大鼠体内整体代谢产生了显著影响， 在低剂量和高剂量暴露组中分别鉴定出14种和32种差异代谢物， 其中10种差异代谢物在2种剂量组中均被鉴定出， 这表明长期高剂量砷暴露对机体代谢产生的干扰更显著。对差异代谢物涉及的代谢通路进行分析， 结果表明， 长期砷暴露会导致氨基酸和脂类代谢异常及核苷酸代谢紊乱， 并干扰蛋白质的表达与翻译后修饰。以上通路的改变均可作为砷毒性机理的关键分子事件， 以此为靶点， 结合常规毒理学研究方法和多组学联用技术， 对这些生物学过程中的关键节点进行深度研究， 有助于对砷毒性分子机制的深度解析。

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