李维薇 汪受传 单进军 戴启刚 徐珊 谢彤 林丽丽 杜丽娜 杨燕

摘 要 利用超高效液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱质谱联用技术（Ultra-high performance liquid chromatography with linear ion trap-orbitrap mass spectrometry， UHPLC-LTQ/Orbitrap-MS）对胆道闭锁患儿（Biliary atresia，BA）和健康婴儿（Normal control， NC）的尿液进行代谢组学分析，筛选胆道闭锁患儿尿液中的潜在生物标志物。收集了32例胆道闭锁患儿及40例健康婴儿的尿液样本，获得尿液样本的代谢轮廓，通过主成分分析法（Principle component analysis， PCA）及正交偏最小二乘法-判別分析（Orthogonal partial least squares discriminant analysis， OPLS-DA）等多元统计分析，最终筛选并鉴定32种内源性差异代谢物可作为胆道闭锁潜在的生物标记物。涉及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，精氨酸和脯氨酸代谢，D-谷氨酸和D-谷氨酰胺代谢，组氨酸代谢，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢通路紊乱。提示在胆道闭锁过程中伴随广泛的蛋白质代谢紊乱。其中，谷氨酸、L-谷氨酰胺、瓜氨酸、脯氨酸、胍基乙酸、5'-甲硫腺苷、ε-（γ-谷氨酰）-赖氨酸等物质表达差异趋势明显，涉及一系列胆道闭锁相关的病理机制。本研究为了解胆道闭锁的发病机制和早期筛查提供了科学依据。

关键词 胆道闭锁; 超高效液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱质谱; 代谢组学; 尿液; 生物标志物

1 引 言

胆道闭锁（Biliary atresia，BA）是一种机制尚不明确的胆管破坏性疾病，表现为肝内外胆管阻塞，并可导致淤胆性肝硬化，是小儿外科领域常见病之一[1]。胆道闭锁早期及时进行Kasai手术可有效改善肝脏功能，帮助胆汁顺利排出[2]。通过该手术，约50%的患者术后5年可维持较好的肝功能[3]。如不及时治疗，胆道闭锁患儿会在两年内死于肝脏衰竭[4]。临床常用经内镜逆行性胰胆管造影（Endoscopic retrograde cholangiopancreatography，ERCP）和肝脏活检诊断胆道闭锁。但这两种检查手段均为有创检查，会对患儿的健康造成损害，且诊断的准确率有待提高[5]。运用新技术筛选胆道闭锁的生物标记物，有助于了解该疾病的发病机制，有利于快速临床诊断和治疗。

近年来，代谢组学发展技术发展迅速。在临床医学领域，利用代谢组学技术可研究疾病发病机制，发现疾病生物标记物以及监测疾病进程[6～9]。但目前有关胆道闭锁的代谢组学研究较少，Zhao等[10]基于液相色谱-质谱联用技术（Liquid chromatography-mass spectrometry， LC-MS）对胆道闭锁患儿的血浆样本进行探究，发现与婴儿肝炎综合征相比，胆道闭锁患儿在氨基酸代谢和酰基肉碱代谢存在紊乱。Zhou等[11]同样采用LC-MS技术，针对胆道闭锁患儿的胆汁酸代谢进行研究，发现胆道闭锁患儿的牛磺酸脱氧胆酸显著上调，而鹅去氧胆酸显著下调。本研究组前期采用气相色谱-质谱联用技术（Gas chromatography-mass spectrometry， GC-MS）进行婴儿巨细胞病毒（Human cytomegalovirus， HCMV）肝炎的研究时也发现，合并HCMV感染的胆道闭锁患儿血浆样本代谢特征与婴儿肝炎综合征及婴儿胆汁淤积性肝病患儿存在较大差异[12]。随后又采用GC-MS技术探究了胆道闭锁患儿尿液样本的代谢特征，并基于胆道闭锁的尿液特征性代谢物构建了诊断模型[13]。但由于检测仪器的特性，GC-MS技术仅能检测m/z 50～500的小分子物质，无法全面了解胆道闭锁的发病机制及代谢特征。因此，采用检测范围更广的仪器，可望进一步发现胆道闭锁相关代谢物，阐明其代谢机制。

考虑到尿液样本的收集过程简单且安全，无创伤性，对婴儿没有任何危害和副作用， 婴儿饮食结构简单，受外环境影响较小，是进行尿液代谢组学研究的理想对象，因此本研究采用患儿的尿液样本进行胆道闭锁的代谢组学研究。利用超高效液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱质谱联用（Ultra-high performance liquid chromatography with linear ion trap-orbitrap mass spectrometry， UHPLC-LTQ/Orbitrap-MS）技术检测胆道闭锁患儿与正常对照组婴儿的尿液样本，通过主成分分析法筛选潜在的生物标志物，为进一步探讨胆道闭锁的发病机制提供科学依据。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Dionex UltiMate 3000 超高效液相色谱仪和线性离子阱/静电场轨道阱质谱（美国Thermo Fisher公司）; Allegra 64R Centrifuge型离心机（美国Beckman Coulter公司）; Synergy型超纯水系统（美国Millpore公司）。乙腈（HPLC级，德国Merck公司）; 甲酸和甲酸铵（HPLC级，美国ROE Scientific公司）; 内标13C5-L-Glutamine和13C2-L-Tryosine（美国Sigma-Aldrich公司）。

2.2 样本来源及处理

胆道闭锁患儿尿样和健康婴儿尿样均由首都医科大学附属北京儿童医院提供，经过北京儿童医院机构伦理委员会批准，所有患儿监护人均签署了知情同意书。以2016年1月～2016年12月在北京儿童医院经胆道造影确诊为胆道闭锁的32例患儿为研究对象，同时选取同时期在北京儿童医院通过体检确定为健康的婴儿40例。两组患儿的一般情况见表1。取两组婴儿晨起空腹第一次尿液约2 mL，于80℃保存。

取90 μL样品，于室温下溶解，加入100 μL含有20 μg/mL内标13C5-L-Glutamine和13C2-L-Tryosine的双蒸水稀释尿样。涡旋振荡10 min，17000 r/min离心10 min，取上清液150 μL，再以17000 r/min离心10 min，取上清液100 μL，待测。

2.3 色谱及质谱条件

色谱条件： Waters ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱（150 mm × 2.1 mm，1.7 μm），流动相A为含0.1%甲酸和10 mmol/L甲酸铵的水溶液，流动相B为含0.1%甲酸和10 mmol/L甲酸铵的乙腈/水溶液（95∶5，V/V）。梯度洗脱程序： 0～2 min，100% B; 2～7.7 min，70% B; 7.7～9.5 min，40% B; 9.5～10.25 min，30% B; 10.25～12.75 min，30%～100% B; 12.75～16 min，100% B。柱温40℃; 流速0.4 mL/min; 正离子模式下进样量2 μL，负离子模式下进样量5 μL。

质谱条件： 采用电喷雾离子源（ESI），正、负离子全扫模式检测，喷雾电压4.5 kV，离子源电压3.5 V，离子源温度300℃，鞘气45 arb，辅助气10 arb。MS1谱图通过FTMS模式获取，质量扫描范围m/z 80～1000，分辨率30000 FWHM; MS2谱图通过ITMS模式获取，分辨率7500 FWHM，碰撞能35 eV。

2.4 数据处理与分析

2.4.1 数据质量评价 所有尿液样本均取100 μL等量混合，制成质量控制样本（Quality control，QC），处理方法同一般尿液样本。样本检测前先进5针QC样本，使系统平衡。每隔10个样本插入1个QC样本进行检测，同时所有样本按Excel生成的随机数字表进样，以消除进样次序对分析结果的影响。根据QC样本中分布于不同保留时间的代表性离子的色谱峰强度信息，对仪器系统的稳定性和分析数据的质量进行评价。采用PCA分析评估QC样本聚类效果，并为后续样本预处理参数设定提供依据。

2.4.2 数据预处理 原始质谱数据采用ABF converter（http：//www.reifycs.com/AbfConverter/ index.html）软件转换为“abf”格式，利用MS-DIAL[12]进行数据预处理，包括峰提取、峰校准、滤噪和数据简化处理，并通过Mona数据库（http：//mona.fiehnlab.ucdavis.edu/）进行物质鉴定，得到三维矩阵数据集，坐标分别为： 化合物名称、保留时间及根据峰高提取的峰面积（Peak heigh）。随后对数据集进行Loess校准（Loess normalization）及Pareto校准（Pareto scalling）。

2.4.3 多元统计分析 采用MetaboAnalyst 4.0[13] （http： / /www.metaboanalyst.ca）进行PCA和OPLS-DA分析。同时，对数据进行对数转换（Log transformation），使其基本满足正态分布及方差齐性，进行组间独立样本t检验和倍数变化（Fold change， FC）分析。根据FC及t检验所得的p值及False discovery rate（FDR）值筛选差异性代谢物，当 FC>1.50或 FC<0.67及FDR<0.05 时，提示该代谢物为胆道闭锁潜在生物标志物。

2.4.4 潜在生物标志物鉴定及代谢通路分析 根据精确分子量和MS/MS 结果以及与HMDB、METLIN数据库或标准品进行比较，鉴定尿液中胆道闭锁潜在的生物标志物。随后，将这些代谢物导入MetaboAnalyst 4.0中进行代谢通路分析。

3 结果与讨论

3.1 胆道闭锁患儿和正常婴儿尿液LC-MS总离子流图

尿液样本采用UHPLC-LTQ/Orbitrap-MS分别在正负离子模式下进行检测分析。图1为随机选取一例正常婴儿和一例胆道闭锁患儿的在正负离子模式下的总离子流图（Total ion current，TIC）。由图1可见，不同类型的代谢物均得到较好分离。本研究从谱图中最终鉴定出34个差异性代谢物，如图1A及图1C中的标记，相应代谢物的详细信息见表2。为获取谱图中详细定量生物学信息，进一步采用PCA和OPLS-DA分析对胆道闭锁组和正常对照组之间的差异进行评估。

3.2 数据质量评价

将经过loess校准后的数据集导入MetaboAnalyst 4.0软件进行PCA分析。如图2所示，正离子和负离子模式下，QC样本位于95%置信区间内，且集中于一点，代表质量控制样本偏差小，实验过程中仪器误差及人工误差均较小。经计算，正离子模式下QC内各离子峰面积的相对标准偏差（RSD）均值为4.4%，负离子模式下QC内各离子峰面积的RSD均值为8.6%，表明数据可靠。

3.3 胆道闭锁代谢轮廓分析及差异性代谢物鉴定

采用PCA分析统计胆道闭锁组和正常组尿样中的代谢物变化趋势。图3为正负离子模式下的PCA得分图。图3中每个点代表一个样本在二维平面上的投影，每个样本的位置由其自身的代谢决定。处于相似的生理病理状态的样本通常具有相似的代谢状态，因此在PCA得分图上也会处于相似的位置。如图3所示，胆道闭锁组与正常组分别聚集，两组呈分离趋势。

进一步对两组进行OPLS-DA分析。由两组正負离子模式下的OPLS-DA图（图4）可见，胆道闭锁组婴儿与正常组婴儿完全区分，提示胆道闭锁与正常婴儿的尿液确实存在代谢差异。通过FC>1.50或 FC<0.67及t检验（FDR<0.05）筛选胆道闭锁潜在的生物标志物。

3.4 潛在生物标志物的鉴定

根据精确分子量和MS/MS结果以及与HMDB、METLIN和Mona数据库比较，鉴定尿液中潜在的胆道闭锁生物标志物。以负离子模式下的离子m/z 154.0622为例说明生物标记物的鉴定过程。该离子的提取离子色谱图及在保留时间10.04 min时的组分质谱图如图5A和5B所示。将结果与数据库中化合物进行对比，初步鉴定化合物为组氨酸。如图5C所示，串联质谱的分析结果与标准品的结果完全一致，因此被鉴定为组氨酸。以同样方法鉴定其它化合物，其中一些化合物未能鉴定出。表2列出了潜在的34种生物标志物的鉴定结果。

3.5 胆道闭锁潜在生物标志物可能的生理学意义

将鉴定出的34种化合物数据导入MetaboAnalyst 4.0中进行代谢通路分析，根据通路影响值和显著性分析，确定胆道闭锁相关的代谢通路（富集分析p<0.05，impactor factor>0.1）。如图6所示，有5条在胆道闭锁过程中较为重要的代谢通路，分别为丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，精氨酸和脯氨酸代谢，D-谷氨酸和D-谷氨酰胺代谢，组氨酸代谢，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，提示在胆道闭锁过程中伴随广泛的蛋白质代谢紊乱，且氨基酸类差异性代谢物， 如N-乙酰-L-赖氨酸、N-乙酰基-L-精氨酸、赖氨酰-天冬氨酸、L-脯氨酸、L-高瓜氨酸、瓜氨酸、L-谷氨酰胺、N-乙酰甘氨酸、苏氨酸、组氨酸、谷氨酸等，在胆道闭锁组均呈现上调趋势。

本研究中胆道闭锁患儿均存在不同程度的肝脏损害，肝脏是氨基酸代谢的主要场所，肝病过程中必然会伴随氨基酸代谢的扰动。Zhou等[16]在基于血浆样本的代谢组学研究中同样发现，胆道闭锁患儿体内7种氨基酸含量呈上调趋势，与本研究的结果一致。在本研究中，谷氨酸及谷氨酰胺参与了3条代谢通路。文献[17]报道了L-谷氨酸可作为体内的保护调节剂，用于应对氧化应激、肠道损伤及信号转导抑制。此外，考虑到胆道闭锁组患儿ALT水平整体呈升高趋势，谷氨酸也可能来源于ALT催化丙氨酸与α-酮戊二酸生成。

精氨酸和脯氨酸代谢通路紊乱同样存在于胆道闭锁组。精氨酸的上下游代谢物，如L-谷氨酸、谷氨酰胺、瓜氨酸及脯氨酸，在胆道闭锁组上调，胍基乙酸在胆道闭锁组下调。这一代谢紊乱同样见于以黄疸为主要表现的肝病患者[18]。BA患儿也存在不同程度的黄疸症状，推测精氨酸和脯氨酸代谢可能与胆红素代谢紊乱有一定相关性。在前期研究[13]中发现，胆道闭锁患儿的血浆样本中同样存在精氨酸和脯氨酸代谢通路紊乱，其中，鸟氨酸、谷氨酰胺及胍基乙酸在胆道闭锁组呈上调趋势。

5'-甲硫腺苷在胆道闭锁组显著上调，5'-甲硫腺苷是蛋氨酸合成的中间物质，由5'-脱氧-5'-甲硫腺苷经5'-脱氧-5'-甲硫腺苷磷酸化酶转化生成，随后生成蛋氨酸，5'-甲硫腺苷的显著上调会导致蛋氨酸含量的升高。有文献报道肝细胞功能不全的患者血浆蛋氨酸升高，且蛋氨酸代谢中主要酶的mRNA水平降低[19，20]，与本研究结果相一致。

胆道闭锁组尿液中牛磺熊去氧胆酸（Tauroursodeoxycholic acid， TUDCA）也呈显著上调。TUDCA可减少胆汁酸诱导产生的细胞凋亡和细胞溶解[21]，广泛用于治疗原发硬化性胆管炎、原发性胆汁性肝硬化和慢性肝炎等常见疾病[22]。推测胆道闭锁组TUDCA上调与服用此药物相关。

酒精性肝病、原发性胆汁性肝硬化及肝外胆道闭锁等疾病可见到肝细胞玻璃样变，胞质中细胞中间丝前角蛋白变性的病理改变，称Mallory小体[23]。研究表明，Mallory小体内存在大量由ε-（γ-谷氨酰）-赖氨酸构成的蛋白质交联[24]。推测这可能是患儿组ε-（γ-谷氨酰）-赖氨酸升高的原因。

虽然不能忽视研究对象饮食对于尿液代谢产物的影响，但考虑到所有研究对象均为约3个月的婴儿，饮食结构简单，且采集的尿液样本均为通宵禁食后的晨尿，认为饮食对本研究的影响较小。

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