赵 倩， 杨 亮， 朱丽萍

(新疆医科大学附属肿瘤医院乳腺外科一病区, 乌鲁木齐 830011)

尽管癌症研究取得了巨大进步，但乳腺癌仍然是一个主要的健康问题，并且目前是生物医学研究的重中之重。在世界范围内，乳腺癌是影响女性的最常见癌症，其发病率和死亡率预计将在未来几年显著增加。根据2015年中国癌症中心统计的数据显示，我国乳腺癌的发病率呈逐年上升的趋势，已成为女性常见的恶性肿瘤[1-2]。乳腺癌转移仍严重影响预后，并且是导致死亡的主要原因；诊断为早期乳腺癌的患者，在接受辅助治疗后，有30%的患者最终会不可避免地复发与转移。对于恶性肿瘤的局部浸润与转移，其具体发生的机制，目前尚未十分明了，但已知是一系列步骤组成的复杂过程，micro RNA(miR)和长链非编码RNA(long chain non-coding RNA，lncRNA)是潜在的治疗靶标。目前最新研究发现，乳腺癌细胞出现淋巴结转移和部分lncRNA密切相关，所以分析乳腺癌淋巴结转移和lncRNA关系非常重要。越来越多的证据已经揭示了lncRNA表达量的异常变化与功能变化，能够对多种恶性肿瘤的发展过程产生影响，并且可以直接参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、转移、免疫调控以及耐药等过程[3-5]，如lncRNAs HOTAIR、SPRY4-IT1、GAS5和PANDAR等。lncRNA涉及多种细胞功能的调节，其失调通常与包括癌症在内的人类疾病相关。转移相关的肺腺癌转录物1(MALAT1)是最丰富和高度保守的lncRNA之一。新的证据表明，MALAT1可能在癌症的发展和进展中具有复杂和广泛的功能。MALAT1(也称为NEAT2、HCN、LINC00047、NCRN00047和PRO2853)定位于人染色体11q13。MALAT1 RNA的长度为8.7 kb，来自单个外显子，主要定位于胞核。MALAT1最初在筛选中被鉴定为与非小细胞肺癌(NSCLC)中转移和患者存活相关的转录物[6]，提示它具有非常重要的生物学功能。目前对引起乳腺癌淋巴结转移相关的lncRNA研究较少，本研究分析MALAT1在乳腺癌组织、腋窝淋巴结组织及前哨淋巴结中的表达情况，为乳腺肿瘤的基因治疗提供新策略。

1 材料与方法

1.1 临床资料所有入组患者均签署知情同意书，本研究已通过新疆医科大学附属肿瘤医院的伦理学审核，收集新疆医科大学附属肿瘤医院乳腺外科一病区2018年10-12月收治的乳腺癌住院患者20例，均采用乳腺手术+前哨淋巴结活检术，术前已通过穿刺，病理学诊断为乳腺浸润性癌，术中留取手术切除的原发性肿瘤组织和配对癌旁组织，用前哨淋巴结(sentinel lymph node,SLN)探测仪，对于亚甲蓝染料检出SLN≥2枚且术中冰冻示SLN有转移的患者，再行常规腋窝淋巴结(axillary lymph node，ALN)清扫。获得同时满足SLN(+)及ALN(+)的乳腺癌患者12例，分别取SLN、ALN及乳腺癌组织、癌旁组织，入组患者的临床资料见表1。

1.2 标本处理取12例患者的前哨淋巴结及腋窝淋巴结组织，其中一半淋巴结进行冰冻检查，另一半淋巴结在液氮中速冻，组织置于-80℃冰箱保存，加入组织裂解液进行裂解，采用Trizol法提取总RNA，纯度及浓度检验合格后-80℃冰箱保存。癌组织、癌旁组织同上处理。

表1 12例入组患者的临床资料/例

注：ER：雌激素受体；PR：孕激素受体；ALN：腋窝淋巴结：SLN：前哨淋巴结。

1.3 总RNA提取及逆转录采用Trizol法提取各组织的总RNA，采用分光光度仪进行RNA的定量计算，当A260/A280比值在1.8～2.0为满意纯度，记录RNA浓度。采用琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，当RNA电泳符合18S、28S条带，RNA无降解；肉眼观察28S条带亮度是18S条带亮度的1～2倍时，进行RNA反转录。采用反转录反应试剂盒，采用20 μL反应体系，经普通PCR，37℃、60 min，95℃、5 min逆转录，4℃保存。采用qRT-PCR法检测lncRNA的表达，用2-△△ct法计算lncRNA MALAT1的相对表达量。以甘油醛-3-磷酰脱氢酶(GAPDH)作为内参，lncRNA MALAT1及内参所用引物见表2。

表2 qRT-PCR检测MALAT1各片段表达所用引物

2 结果

2.1 RT-PCR检测lncRNAMALAT1在各组织的表达通过2-△△ct法计算lncRNAMALAT1在各组织中的相对表达情况见表3。由表3可见，各组织中MALAT1相对表达量差异有统计学意义(F=11.357，P=0.000)，MALAT1在SLN中的表达明显高于癌旁组织与癌组织，差异有统计学意义(P<0.05)。乳腺癌组织中MALAT1的表达量明显高于癌旁组织和ALN组织，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

表3 lncRNAMALAT1在各组织中的表达情况

注：与SLN比较，*P<0.05； 与癌组织比较，#P<0.05。

图1 lncRNAMALAT1的相对表达量

注：与SLN比较，*P<0.05； 与癌组织比较，#P<0.05。

2.2 SLN中MALAT1表达情况与患者淋巴结转移、淋巴结转移率和远处转移的关系参考qRT-PCR结果分析，MALAT1的表达与乳腺癌患者临床病理指标的关系显示，MALAT1与淋巴结转移率呈正相关(r=0.784,P<0.05)，淋巴结转移率高，MALAT1的表达也越高，但与远处转移和淋巴结转数目不相关，见表4。

表4 乳腺癌患者MALAT1表达水平与SLN淋巴结转移情况

3 讨论

关于肿瘤淋巴结转移相关RNA分析研究都集中在蛋白质编码的基因组的部分，然而人类基因组包含数以千计的lncRNAs和乳腺癌淋巴结转移关系有重要的研究意义。目前最新研究发现，乳腺癌出现淋巴结转移和部分lncRNA密切相关[7-9]，所以分析乳腺癌淋巴结转移和lncRNA关系非常重要。

本研究结果显示，MALAT1在前哨淋巴结以及癌组织中的表达量异常增高，刘峰等[10]研究显示，在乳腺癌中淋巴结转移组lncRNA MALAT1的相对表达量均高于对照组，提示MALAT1可能参与了乳腺癌的淋巴结转移过程，本研究与其结果相一致，MALAT1在乳腺癌腋窝淋巴结转移中表达明显升高，可能是预测肿瘤转移和预后的重要指标。因此，MALAT1有可能作为乳腺癌基因治疗的新靶点，对于前哨淋巴结阳性患者，术后辅助化疗的同时，可给予基因靶向治疗。

吴钧等[11]研究表明，乳腺癌组术前血浆MALAT1的相对表达量高于良性组及健康对照组，而良性组与健康对照组之间差异无统计学意义。术后血浆MALAT1相对表达较术前相比降低，本研究结果表明其在乳腺癌患者癌组织中的表达升高，与其在乳腺癌血浆中异常高表达的报道相一致。Jadaliha等[12]研究表明，下调乳腺癌细胞中MALAT1表达后，利用qPCR芯片方法检测发现数个上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关基础mRNA的表达随之降低，MALAT1可能通过某种机制改变EMT相关基因的表达，从而影响癌细胞的侵袭和转移。本研究也发现，癌组织中的MALAT1水平与患者的淋巴结转移相关，在前哨淋巴结的表达量明显高于癌组织，与上述MALAT1具有促进癌细胞转移能力的结论相符。

近几年采用基因表达和免疫组化的方法将乳腺癌分为Luminal A、Luminal B、cerbB-2过表达型和基底样型4大类。其中，基底样型乳腺癌又称三阴性乳腺癌，指雌激素受体、孕激素受体和cerbB-2表达均为阴性的乳腺癌，约占所有乳腺癌患者的15%，其生物学特点表现为侵袭性强，易出现淋巴结转移，因缺乏内分泌及cerbB-2治疗的靶点，此类乳腺癌患者预后较差[13-15]。本研究后续将进一步研究 MALAT1对三阴性乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。

MALAT1在非小细胞癌、宫颈癌、前列腺癌和结肠癌等肿瘤中过表达，同时在细胞周期和细胞凋亡中扮演着调节作用[16]。今后应继续进行相关MALAT1在乳腺癌细胞功能学中的研究。

综上所述，MALAT1在乳腺癌患者癌组织中高表达，并且在前哨淋巴结中的表达量异常高表达，检测前哨淋巴结及癌组织中MALAT1的表达可在治疗方案的选择中发挥作用。