何合胜，靳小可，刘善浩，徐又海，杨玉琼，齐 晶

(皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院 血液内科，安徽 芜湖 241001)

自身免疫性溶血性贫血(autoimmune hemolytic anemia，AIHA)是由于产生抗自身红细胞抗体导致红细胞破坏发生溶血性贫血的一种器官特异性自身免疫性疾病。AIHA确切的发病机制非常复杂，对该病的研究目前更多集中在体液免疫及细胞免疫方面[1]。B淋巴细胞由于其分泌抗体的功能长期被认为在AIHA的发病机制中发挥重要作用，在临床应用中针对CD20的单克隆抗体清除B淋巴细胞作为AIHA的二线治疗手段，其对部分患者有效也进一步支持B淋巴细胞数量或者功能异常可能导致AIHA疾病发生。B淋巴细胞活化因子(B-cell activating factor of the TNF family，BAFF)属于肿瘤坏死因子超家族成员，一般在巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞表达，对B淋巴细胞的增殖、分化及生存发挥重要作用[2]。鉴于B淋巴细胞在AIHA发病中的作用及BAFF与B淋巴细胞的相关性，我们通过流式细胞检测CD3-CD19+B淋巴细胞的变化及ELISA方法检测BAFF水平，探讨上述两个指标在AIHA发病中的变化及意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2015年8月～2018年6月在弋矶山医院及皖南医学院第二附属医院门诊及住院AIHA初发患者22例，其中男9例，女13例，年龄23～71岁，中位年龄52岁。纳入健康志愿者14例，男6例，女8例，年龄25～57岁，中位年龄45岁。EDTA管抽取外周静脉血进行流式细胞检测，所有外周血血清采集分离后冻存于-80℃冰箱留作ELISA检测时使用。

1.2 主要试剂及仪器 流式细胞仪检测标记的抗体均购自eBioscience公司，BAFF的ELISA法检测试剂盒购自R&D公司。流式细胞仪为BD公司产品。

1.3 实验方法 分别抽取AIHA患者和健康志愿者外周静脉血2 mL，EDTA抗凝处理后，取100 mL新鲜EDTA管抗凝的血标本加入样品测定管内，以CD3-CD19+淋巴细胞作为B淋巴细胞标记，通过流式细胞仪检测CD3-CD19+B细胞占淋巴细胞总数的百分比。血清BAFF水平检测采用定量ELISA法。

1.4 统计学处理 采用SPSS 18.0统计软件进行数据处理。数值以均数±标准差表示，组间差异采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组外周血淋巴细胞分析 结果显示，AIHA患者外周血中淋巴细胞绝对值与健康志愿者组差异无统计学意义(t=0.952，P=0.348)。见表1。

表1 两组外周血淋巴细胞分析

组别n淋巴细胞绝对值 /(109/L) 健康志愿者141.31±0.30AIHA患者221.18±0.45

2.2 两组外周血CD3-CD19+B细胞的表达 结果显示，AIHA患者CD3-CD19+B细胞比例较健康志愿者升高，差异有统计学意义(t=2.793，P=0.009)。见表2。

2.3 两组外周血BAFF浓度的检测 结果显示，AIHA患者细胞培养上清液中BAFF浓度较健康志愿者升高，差异有统计学意义(t=5.449，P=0.000)。见表3。

3 讨论

AIHA 作为一种自身免疫性溶血疾病，目前针对该病的发病机制研究更多集中在体液免疫及细胞免疫方面[1]。近年来国内外学者分别从T、B淋巴细胞两方面对AIHA疾病进行系列研究，试图通过调节患者的免疫功能状态来更精准地治疗AIHA[3]。我们前期的研究发现AIHA患者Th17细胞增高、Breg细胞比例降低[4-5]，我们的研究丰富了对AIHA发病机制的更多认识。但是针对AIHA的发病机制研究，仍有许多悬而未决的问题，值得我们继续进行后续相关的研究。

表2 两组外周血CD3-CD19+B细胞的表达

组 别nCD3-CD19+B细胞/% 健康志愿者1411.38±3.17AIHA患者2215.79±5.32

表3 两组外周血BAFF浓度

组别nBAFF浓度/ (ng/L) 健康志愿者14397.2±95.3AIHA患者22627.9±138.6

目前认为，B淋巴细胞功能或数量异常产生的抗红细胞自身抗体是AIHA发病的主要因素之一。近年来，B淋巴细胞在AIHA发病机制中的作用日益受到重视。B淋巴细胞介导的体液免疫反应是一个非常复杂的过程，其活化、增殖、分化等受到多种体内外因素影响。有研究显示同为自身免疫性疾病的ITP患者B淋巴细胞增高，推测可能与B淋巴细胞凋亡减少和过度增殖有关[6]。在我们的研究中，AIHA患者CD3-CD19+B细胞较健康志愿者增高，也支持B淋巴细胞参与AIHA的发病过程。但我们前期的研究表明AIHA患者呈现负向免疫调节功能的调节性B细胞水平下降[5]，因此B淋巴细胞在AIHA发病中具体的免疫调节作用应结合B细胞的不同亚群决定。

BAFF是肿瘤坏死因子超家族成员之一，为一种促进B细胞成熟和分化的刺激因子，能够促进B淋巴细胞的增殖及分化。有研究[7]显示,BAFF表达减少可导致B细胞数目下降并进一步影响体液免疫功能,BAFF过表达可激活自身反应性B细胞，通过使B淋巴细胞分化为浆细胞，从而不断分泌自身抗体，在自身免疫性疾病的发生和进展中发挥一定的作用。已有研究证实[8-10]在系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、ITP等自身免疫性疾病患者血清中存在高水平的BAFF。本研究证实AIHA患者血清BAFF水平高于对照组，进一步支持BAFF在AIHA的发病中起到一定的作用。我们推测BAFF高表达激活自身反应性B细胞，不断产生针对自身红细胞的抗体，促进红细胞破坏从而发生自身免疫性溶血。由于我们的条件有限，无法针对所有患者的红细胞自身抗体常见类型IgG、C3检测，因此无法评价BAFF浓度与红细胞自身抗体类型是否存在一定关联。临床工作中通过检测AIHA患者不同阶段的BAFF水平，有助于评估疗效，指导治疗，同时也可以针对BAFF靶点开发出有针对性的靶向药物。

目前治疗AIHA的首选药物为糖皮质激素，但由于该药不能从根本上彻底阻断根治AIHA，部分患者停用激素后存在复发或需要长期激素维持治疗。相当多的患者因为糖皮质激素的不良反应，不能坚持长期服药。另外有少部分患者经过激素、切脾治疗后仍不能控制病情，迫切需要开发出更多治疗AIHA的药物。Belimumab(贝利木单抗)是第一个全人源化抗BAFF单克隆抗体，它通过特异性阻断可溶性BAFF与BAFF受体的结合，从而抑制B细胞的生长，包括自体反应性B 细胞。同时减少B细胞分化为成熟浆细胞从而减少免疫球蛋白的产生[11]。目前已用于系统性红斑狼疮等自身免疫系统疾病的治疗[8]。因此贝利木单抗对于AIHA，尤其难治复发性AIHA患者是一个可供选择的治疗药物。

总之，我们的研究提示AIHA患者外周血BAFF浓度增高，可能促进B淋巴细胞活化，在AIHA发病中起着重要的作用，该研究结果有助于在临床工作中通过检测AIHA患者中的CD3-CD19+B细胞及BAFF浓度变化，能够更全面地评估患者疗效、病情演变，同时为通过针对BAFF的靶向药物干预BAFF水平从而靶向治疗该疾病提供新的方向。