赵万隆，程伟，陈剑

1.上海市青浦食品药品检验所，上海 201799；2.信阳市食品药品检验所，河南 信阳 464000

通降汤处方是由中医师依据多年临床实践经验总结并开发的医疗机构制剂，由大黄、党参、丹参、当归、白术、附片、干姜、甘草等药材组成的中药制剂，具有温阳健脾、泄浊化瘀的功效，主要用于脾肾阳虚、湿浊内蕴所致的畏寒肢冷、倦怠乏力、食少纳呆、脘腹胀满、腰膝酸软，慢性肾功能衰竭见上述证候者。大黄为方中君药，现代药理研究表明，大黄具有调节胃肠功能、保护心脑血管、抗肿瘤及调节免疫力等药理作用[1]。氮代谢紊乱是慢性肾衰竭患者的突出表现，大量实验和临床研究均证明，大黄具有改善氮代谢的作用[2]。有研究表明，大黄素可促进骨形态发生蛋白-7(BMP-7)的表达，从而发挥延缓肾间质纤维化进程的作用，对肾纤维化有一定的治疗作用[3]。当归具有防治肾缺血再灌注损伤的作用[4]，研究表明，经过当归补血颗粒治疗的大鼠，肌酐和尿素氮明显减低，并改善肾组织和蛋白表达[5]。丹参中丹酚酸B能抑制肾小球滤过率大鼠肾皮质细胞内钙离子含量的增加，并能减少内皮素与肾皮质细胞内皮素(endothelin，ET)的合成与释放，使得肾血管舒张，血流量增多，改善肾功能[6]。为了有效地控制本制剂的质量，本研究采用TLC对处方中君药大黄进行定性鉴别，同时建立高效液相色谱法对制剂中阿魏酸、丹酚酸B、甘草酸铵和大黄素的含量测定，以此建立通降汤的质量标准。

1 材料

1.1 仪器

安捷伦1200高效液相色谱仪；梅特勒电子天平；德国普兰德移液枪(5、1 mL)。

1.2 试药

大黄素对照品、阿魏酸对照品、丹酚酸B对照品、甘草酸铵对照品(中国食品药品检定研究院，批号分别为：110756-201512、110773-201313、111562-201514、110731-201619)；流动相溶液为色谱纯；其余试剂均为分析纯。

通降汤由信阳市中医院制剂室提供(批号分别为20171216、20180622、20180919)。

2 方法与结果

2.1 定性鉴别

取通降汤样品30 mL，用乙醚振摇萃取2次，每次使用乙醚30 mL，合并乙醚液，挥干，取无水乙醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取缺大黄的阴性样品30 mL，同法制成阴性样品溶液。再取大黄素对照品，加无水乙醇制成质量浓度为1 mg·mL-1的溶液，作为对照品溶液。吸取供试品、对照品和阴性样品3种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(20∶4∶0.5)为展开剂，展开，取出，晾干。在与对照品色谱相应的位置上，供试品色谱应显相同的黄色斑点[7]；置氨蒸气中熏后，斑点变为橙红色，且阴性样品在相应位置上无相同颜色斑点，说明阴性无干扰。见图6。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件 安捷伦ZORBAX-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：A-乙腈，B-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱(0～5 min，20%A；5～15 min，20%～30%A；15～30 min，30%～50%A；30～45 min，50%A)；检测波长：0～14 min为321 nm(阿魏酸)，14～22 min为286 nm(丹酚酸B)，22～35 min为250 nm(甘草酸铵)，35～45 min为254 nm(大黄素)；流速：1.0 mL·min-1；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。

注：A.氨蒸气熏前；B.氨蒸气熏后；1.大黄素；2～4.样品；5.阴性。图1 大黄薄层色谱图

2.2.2 对照品溶液 分别精密称定阿魏酸对照品、丹酚酸B对照品、大黄素对照品和甘草酸铵对照品适量，以甲醇作为稀释溶剂定容，制成质量浓度分别为626.8、471.2、413.6、584.0 μg·mL-1的对照品储备溶液，分别各精密吸取1、2、1、1 mL置于50、25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀；再分别吸取4个对照储备溶液0.5、1、0.5、0.5 mL置于25、10、5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。共得到5个浓度级别的混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液 精密量取本品5 mL，置于25 mL量瓶中，加甲醇15 mL，振摇处理2 min，用甲醇定容至刻度，摇匀，静置30 min后，取上清液用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 阴性样品溶液 按处方比例和制备工艺分别制备不含当归、丹参、甘草和大黄的阴性样品，再按2.2.3项下方法分别制备阴性样品溶液。

2.3 专属性考察

取2.2.2项下混合对照品溶液、2.2.3项下供试品溶液、2.2.4项下阴性样品溶液，在2.2.1项下的色谱条件下测定，记录色谱图(见图2)。结果显示，供试品中在与对照品色谱上相同保留时间的位置有相同的色谱峰，阴性样品色谱在相同保留时间无色谱峰，证明阴性样品无干扰。

2.4 线性关系考察

精密吸取2.2.2项下的不同浓度的混合对照品溶液各10 μL注入高效液相色谱仪，按照2.2.1项下的规定条件测定，记录峰面积并建立标准曲线方程，横坐标为4种成分的浓度(μg·mL-1)，纵坐标为峰面积，得到阿魏酸的回归方程为Y=26.308X+5.366 4(r=0.999 9)，丹酚酸B的回归方程为Y=18.208X+3.145 4(r=0.999 9)，甘草酸铵的回归方程为Y=11.909X+1.087(r=0.999 9)，大黄素的回归方程为Y=20.757X+0.250 6(r=0.999 9)。结果表明，阿魏酸、丹酚酸B、甘草酸铵和大黄素的进样质量浓度分别在3.13～62.68、4.71～94.24、2.92～58.40、2.07～41.36 μg·mL-1有着较好线性关系。

2.5 精密度试验

精密吸取2.2.1项下的混合对照品溶液10 μL(阿魏酸、丹酚酸B、甘草酸铵、大黄素质量浓度分别为31.34、47.12、29.20、20.68 μg·mL-1)，连续进样6次，按2.2.1项下色谱条件进行测定，记录峰面积。通过计算得到阿魏酸、丹酚酸B、甘草酸铵和大黄素峰面积的RSD分别为0.4%、0.2%、0.5%和0.7%，表明该高效液相色谱仪的精密度较好。

注：A.混合对照品；B.供试品；C.不含当归的阴性样品；D.不含丹参的阴性样品；E.不含甘草的阴性样品；F.不含大黄的阴性样品；1.阿魏酸；2.丹酚酸B；3.甘草酸铵；4.大黄素。图2 通降汤及对照品HPLC图

2.6 稳定性试验

取通降汤供试品溶液，在过滤罐瓶0、2、4、8、12、24 h后上注入高效液相色谱仪，按2.2.1项下色谱条件进行测定，记录峰面积。结果阿魏酸、丹酚酸B、甘草酸铵和大黄素峰面积RSD分别为0.8%、0.4%、1.1%和1.2%。表明24 h内样品溶液的稳定性较好。

2.7 重复性试验

取通降汤样品(20171216)，平行处理6份，按2.2.3项下供试品溶液处理方法得到供试品溶液，上机测定，记录峰面积并计算阿魏酸、丹酚酸B、甘草酸铵和大黄素的含量。通过计算，含量分别为0.125、0.471、0.116、0.083 mg·mL-1，RSD分别为1.0%、1.3%、0.8%和1.2%，表明该方法重复性较好。

2.8 加标回收率试验

取9份通降汤样品(20171216)的样品2.5 mL，分别加入一定量的对照品，按2.2.3项下供试品溶液处理方法制备加标供试溶液，上机测定，记录峰面积，计算各成分回收率。通过计算，阿魏酸、丹酚酸B、甘草酸铵和大黄素的平均加样回收率分别为97.6%(RSD=2.3%)、98.6%(RSD=1.0%)、97.7%(RSD=1.7%)和98.1%(RSD=1.3%)，见表1。

2.9 含量测定

取3批通降汤样品，按规定的方法制备供试品溶液，以摸索好的色谱条件上机测定，记录峰面积，计算含量，结果见表2。

3 讨论

3.1 TLC条件的优化

在TLC试验中，分别尝试了乙醚、三氯甲烷、乙酸乙酯等试剂进行成分提取，除乙醚外其他试剂与药液发生乳化现象，且各种方法都无法有效破乳，故选择乙醚作为提取溶剂。以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(20∶4∶0.5)为展开剂，展开晾干后检视，结果薄层色谱显色效果较好，经氨蒸气熏后，斑点由黄色渐变为橙红色，且阴性样品无干扰。

3.2 波长的选择

本方法在检测波长的选择上，参考待测成分的相关文献[8-12]，按各成分保留时间的不同设置波长数：0～14 min为321 nm，检测阿魏酸；14～22 min为286 nm，检测丹酚酸B；22～35 min为250 nm，检测甘草酸铵；35～45 min为254 nm，检测大黄素，此方法下4个成分都能有较大紫外吸收。而采用单一波长时，只有部分成分紫外吸收较大，其余成分不能得到最大吸收，个别成分甚至没有吸收无法计算和定量，当选择波长切换法，使4个成分在各自的保留时间有最大吸收波长，使定量结果更加准确。

表1 通降汤中各成分的加标回收率试验结果(n=9)

表2 通降汤中各成分的含量测定结果(n=3) mg·mL-1